題目：通過新型“中藥-體內(nèi)化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)方法對復(fù)雜中藥制劑進行品質(zhì)和成分控制:以蓮花清瘟膠囊為例

英文名：Quality and composition control of complex TCM preparations through a novel “Herbs-in vivo Compounds-Targets-Pathways” network methodology: The case of Lianhuaqingwen capsules

雜志：Pharmacological Research

影響因子：9.1

發(fā)表時間：2025年2月12日

研究背景：連花清瘟（LHQW）膠囊是一種由13種草藥成分組成的中成藥，廣泛用于治療呼吸系統(tǒng)疾病。然而，LHQW的復(fù)雜成分對評估其質(zhì)量和一致性提出了挑戰(zhàn)。本研究旨在采用中醫(yī)固有的整體視角，通過整合體內(nèi)和體外的DRUG-seq、RNA-seq和藥效學(xué)驗證數(shù)據(jù)來強調(diào)體內(nèi)暴露視角。系統(tǒng)地篩選了LHQW中表現(xiàn)出高體內(nèi)暴露和顯著活性潛力的化合物，重點關(guān)注藥物吸收、代謝和藥效學(xué)，以建立穩(wěn)健的質(zhì)量控制標志物。

研究思路：首先，使用DRUG-seq評估LHQW各種藥物成分中存在的已鑒定的質(zhì)量控制化合物及其主要代謝物對基因表達的影響，從而指導(dǎo)藥效學(xué)研究的軌跡。其次，使用UPLC-HRMS和一套自主研發(fā)的智能數(shù)據(jù)后處理平臺對大鼠體內(nèi)LHQW相關(guān)組分（包括原型和代謝物）進行全面定性評價，有助于在體內(nèi)系統(tǒng)闡明多種LHQW組分的ADME譜。隨后，建立了一種高效、高靈敏度的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）分析方法，以同時定量大鼠血漿中的各種LHQW成分，研究它們在生物系統(tǒng)內(nèi)的時間動態(tài)。此外，根據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)篩選以體內(nèi)高暴露為特征的潛在活性成分，例如曲線下面積（AUC）、maximum濃度（Cmax）、達到maximum濃度的時間（Tmax）和半衰期（t1/2）。然后，結(jié)合使用病理切片、免疫熒光和RNA-seq在小鼠肺炎模型中探索活性成分的藥理作用和機制。RNA-seq技術(shù)用于預(yù)測與這些活性成分相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)和抗炎機制。此外，通過定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）在脂多糖（LPS）刺激的小鼠巨噬細胞（RAW264.7）中對RNA-seq進行體外驗證。進一步采用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）來評估有前途的候選藥物的抗炎特性。最后，選擇具有高體內(nèi)暴露和抗炎功效的化合物作為LHQW的潛在質(zhì)量控制標志物。這些選擇基于體內(nèi)代謝和藥效學(xué)研究的結(jié)果，為提高LHQW的質(zhì)量控制標準提供了參考。

研究結(jié)果：

1、基于PBMCs快速篩選LHQW中具有免疫或炎癥調(diào)節(jié)作用的主要成分DRUG-seq

本研究利用DRUG-seq技術(shù)評估LHQW中16種主要化合物對健康個體PBMC基因表達的影響。使用UMAP函數(shù)對用16種不同化合物和對照組處理的PBMC進行降維和聚類，發(fā)現(xiàn)所有DRUG-seq組都可以分為兩個簇（0和1），簇0與對照組高度重疊（圖1A）。特征基因的熱圖還揭示了這兩個簇之間的顯著基因差異（圖1B），表明LPS刺激后16種化合物對PBMCs中的基因表達具有顯著的調(diào)節(jié)作用。藥物治療后，兩個基因的表達均顯著降低，表明LHQW膠囊具有抗炎作用，16種化合物的the best濃度顯示出多樣性（圖1D）。GO通路進行GSEA富集分析了哪些通路都受到顯著抑制（NES值為負）（圖1C）。最后，進行了免疫浸潤和Spearman相關(guān)性分析。實驗結(jié)果表明，DL-甲狀腺腫紅蛋白可能促進PBMC中單核細胞分化為樹突狀細胞和M2巨噬細胞，以及B淋巴細胞分化為漿細胞。另一方面，發(fā)現(xiàn)連翹苷可以促進T細胞的功能γδ（圖1E）。

圖1

2、大鼠LHQW的暴露和分布

圖2分別顯示了負離子和正離子模式下PATBS后大鼠血漿樣品中LHQW相關(guān)成分的代表性總離子流色譜圖（TIC）。實驗結(jié)果，大鼠共檢測到505種LHQW相關(guān)化合物（血液中136種，尿液中167種，糞便中160種，膽汁中70種），包括219種原型成分和286種代謝物。這些結(jié)果表明，單次施用LHQW后，大鼠吸收了219種重要的原型成分，同時形成了286種主要代謝物。同時，將化合物的精確二級片段信息與Compound Discoverer3.1軟件、體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化規(guī)則、數(shù)據(jù)庫和標準品質(zhì)量譜破解規(guī)則相結(jié)合，以預(yù)測443種化合物的可能結(jié)構(gòu)，其中52種化合物通過參考標準鑒定。

圖2

如圖3A.72種LHQW相關(guān)化合物在心臟中（44種原型，28種代謝物）、91種在脾臟中（58種原型，33種代謝物）、131種在肝臟中（85種原型，46種代謝物）、163種在肺中（112種原型，51種代謝物）和164種在腎臟中（80種原型、分別鑒定出84種代謝物（圖3B）。為了了解各種大鼠組織中LHQW的主要暴露成分，隨后進行了AUC合并半定量分析。血漿和器官中暴露水平較高的化合物主要來自大黃、甘草、連翹、麻黃（蜂蜜加工）、杏仁（烘干）、金銀花和板藍根（圖3C）。

圖3

3、大鼠LHQW主要成分的代謝途徑和ADME分析

在本研究中，根據(jù)來源和分類，從10種草藥中選擇了27種代表性化合物。這些化合物的代謝途徑進行了表征，并單獨繪制了它們的ADME代謝譜。一般來說，連翹素和連翹素主要通過大鼠的氧化、去甲基化、硫酸化、去糖基化和葡萄糖醛酸化進行代謝（圖4B）。此外，根據(jù)大鼠血液、尿液、糞便和膽汁中連翹素/連翹素及其代謝物的檢測得出ADME代謝譜（圖4D）。同時，發(fā)現(xiàn)蒽醌和有機酸主要在體內(nèi)經(jīng)歷硫酸化和葡萄糖醛酸化等代謝過程，并通過循環(huán)后以原型、硫酸化或葡萄糖醛酸化為特征的代謝途徑被消除。苯乙醇苷主要經(jīng)歷糖基釋放、乙?；⒓谆?、葡萄糖醛酸化和硫酸化代謝，并以原型或葡萄糖醛酸化或糖基釋放糖苷的形式排泄。生物堿主要在體內(nèi)經(jīng)歷氧化、甲基化、去飽和和多層次的復(fù)雜代謝反應(yīng)，主要以體外循環(huán)后去甲基化、去飽和等各種反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的形式排出體外。

圖4

4、大鼠LHQW的多組分定量分析

為了獲得更準確的定量數(shù)據(jù)，采用酶解和甲醇蛋白沉淀法，結(jié)合已建立的HPLC-MS/MS方法，定量測定LHQW給藥后大鼠血漿中的46種化合物。整合大鼠LHQW的藥代動力學(xué)和血漿暴露水平，包括每種化合物在體內(nèi)的代謝狀態(tài)和主要形式，確定了15個潛在的質(zhì)量控制標志物，包括麻黃堿、苦杏仁苷、咖啡酸、奎寧酸、沒食子酸、甘草次酸、甘草酸、甘草素、甘草素、福爾酮素、大黃素、連翹苷A、連翹素、木犀草素、山奈酚和紅景天苷（圖5）。

圖5

5、LHQW和推定的質(zhì)控標志物顯著抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺炎

根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)相似性將15種化合物分為9組，并用作LPS刺激的急性肺炎小鼠模型的治療方式（圖6A）。使用RNA-seq、病理切片和免疫熒光成像評估治療效果。根據(jù)血清中炎癥因子的檢測結(jié)果，與模型組相比，所有藥物治療組血清中促炎細胞因子IL-6和TNF的水平均降低，表明LHQW及其活性亞組分表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性（圖6B）。LHQW作為制劑的效果優(yōu)于每種化合物或藥效學(xué)組的效果（圖6C）。此外，免疫熒光共聚焦顯微鏡顯示LPS誘導(dǎo)組肺組織中M1型標志物蛋白iNOS顯著上調(diào)（圖6D）。值得注意的是，LHQW和復(fù)合亞組處理后肺組織中iNOS表達顯著降低，M2型標志蛋白CD206表達升高，進一步證實了LHQW及其潛在活性化合物的潛在抗炎作用。

圖6

6、肺組織RNA-seq和生物信息學(xué)分析

為了進一步闡明潛在的質(zhì)量控制標志物與肺炎治療相關(guān)的差異表達基因和通路，對每組肺組織進行了RNA-seq分析（圖7A-B）。富集分析顯示，與9個治療組相關(guān)的DEGs在與免疫、炎癥和病毒感染相關(guān)的通路中顯著富集。途徑包括免疫系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)中的細胞因子信號傳導(dǎo)和趨化因子信號通路，它們與免疫反應(yīng)有關(guān)（圖7C）?；贒EG分析構(gòu)建了與LHQW成分相關(guān)的肺部炎癥調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)（圖7D）。對肺組織進行RNA-seq，從而能夠確定每種化合物調(diào)控的相關(guān)靶標和富集通路，初步繪制“草藥-體內(nèi)化合物-靶標-通路”網(wǎng)絡(luò)（圖8）。實驗結(jié)果表明，LHQW和多種潛在的活性化合物或化合物組合對免疫和炎癥基因以及信號通路具有顯著的調(diào)控潛力。

圖7

圖8

7、候選LHQW活性成分的體外抗炎活性

考慮到肺巨噬細胞在調(diào)節(jié)肺炎預(yù)后中的重要作用，進一步采用小鼠原始巨噬細胞系RAW264.7進行LHQW及其活性成分抗炎作用的體外驗證。RT-qPCR分析用于測量RNA-seq鑒定的炎癥相關(guān)基因的mRNA水平，包括STAT1、TNF-α、IL6、ISG15、IFI35、CXCL10、IFIT3和IRF7（圖9）。

圖9

對靶點進行了精細的篩選和驗證，精確定位了關(guān)鍵靶點。這個過程最終構(gòu)建了一個更明確的“Herbs-in vivo Compounds-targets-pathways”多層互連網(wǎng)絡(luò)（圖10）。該網(wǎng)絡(luò)闡明了15種活性成分有助于LHQW抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性的核心機制，可視化了它們在治療框架中的作用。

圖10

總結(jié)：本研究通過構(gòu)建“藥材-體內(nèi)化合物-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，綜合運用DRUG-seq、RNA-seq和藥代動力學(xué)等技術(shù)，篩選出連花清瘟膠囊中15個高暴露且具有顯著活性的潛在質(zhì)量控制標志物，并在細胞和動物模型中驗證了其抗炎效果，為提升連花清瘟膠囊質(zhì)量控制標準提供了科學(xué)依據(jù)。文章實驗及分析方法可模仿復(fù)現(xiàn)，傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！