題目：α-硫辛酸通過(guò)促進(jìn)雞肝細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體β-氧化和減少脂自噬來(lái)改善砷誘導(dǎo)的脂質(zhì)紊亂

英文名：α-Lipoic Acid Ameliorates Arsenic-Induced Lipid Disorders by Promoting Peroxisomal β-Oxidation and Reducing Lipophagy in Chicken Hepatocyte

雜志：Advanced Science

影響因子：2025年1月30日

發(fā)表時(shí)間：14.3

研究背景：肝臟疾病對(duì)全球公共健康構(gòu)成重大威脅，砷（As）被認(rèn)為是導(dǎo)致肝損傷的主要環(huán)境毒素。α-硫辛酸（LA）通常被稱為硫辛酸和1,2-二硫環(huán)戊烷-3-戊酸，是一種天然抗氧化劑，研究表明，LA 在體外和體內(nèi)都能促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗氧化作用、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕毒素的影響、提高免疫力、抑制細(xì)胞凋亡、降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和抑制脂質(zhì)沉積。然而，α-硫辛酸（LA）的具體機(jī)制和保護(hù)作用仍不清楚。

研究思路：本研究利用網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)全面分析了As的肝毒性機(jī)制和LA的保肝機(jī)制，并進(jìn)一步驗(yàn)證了這一過(guò)程中過(guò)氧化物酶體β氧化和噬脂作用的機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，As主要通過(guò)自噬、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝損傷，而LA主要通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝發(fā)揮保肝作用。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，As抑制SIRT1的表達(dá)，激活P53和Notch通路，損傷線粒體，抑制過(guò)氧物酶體β氧化，增加脂質(zhì)積累，增強(qiáng)肝臟的脂吞噬功能；而LA通過(guò)靶向SIRT1，改善線粒體損傷，增強(qiáng)過(guò)氧物酶體β氧化，從而減輕As誘導(dǎo)的肝損傷，減輕As誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累，增強(qiáng)脂吞噬功能。這項(xiàng)研究進(jìn)一步闡明了As肝毒性的機(jī)理，為L(zhǎng)A作為一種潛在的保肝藥物提供了理論依據(jù)。

研究結(jié)果：

1、對(duì)砷誘發(fā)肝損傷潛在機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)分析

通過(guò)CTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出754個(gè)與As相關(guān)的靶基因和1410個(gè)與肝損傷相關(guān)的靶基因（圖1A）。GO、KEGG富集分析顯示，As主要通過(guò)調(diào)節(jié)自噬、凋亡、脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激等相關(guān)通路，影響肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激、增殖、分化、凋亡、自噬、脂質(zhì)代謝和炎癥等生物學(xué)過(guò)程，從而誘發(fā)肝損傷（圖1B-D）。

圖1

2、LA改善了砷誘發(fā)的肝臟結(jié)構(gòu)和功能損傷

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)分析和文獻(xiàn)綜述，發(fā)現(xiàn)LA的生物功能與As的肝毒性機(jī)制有明顯重疊。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)20周的治療，As導(dǎo)致雞體重下降，肝臟中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）含量升高，而與As組相比，400mgkg ?1 LA干預(yù)可增加雞體重，降低肝臟中AST含量（圖2A,C）。與20周的結(jié)果不同，As和LA在治療32周后對(duì)體重和器官系數(shù)沒(méi)有顯著影響。然而，As明顯升高了肝臟中的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平，LA的干預(yù)明顯緩解了這些升高（圖2A-D）。此外，病理學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察顯示，暴露于As20周和32周后，肝臟顏色變淺，肝索排列紊亂，脂滴增多，肝細(xì)胞核溶解和壞死加?。▓D2E,F）。然而，LA干預(yù)可有效改善上述砷誘導(dǎo)的病理和形態(tài)學(xué)改變，其中400mgkg ?1 LA具有更明顯的保護(hù)作用（圖2E,F）。

圖2

3、LA潛在保肝機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

為了進(jìn)一步研究LA的潛在保肝作用，采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法來(lái)鑒定和分析與LA相關(guān)的關(guān)鍵靶基因和生物學(xué)特征。在SwissTargetPrediction和TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出125個(gè)與LA相關(guān)概率大于0的潛在靶基因（圖3A）。此外，GO富集分析結(jié)果顯示，LA主要作用于脂質(zhì)代謝相關(guān)的術(shù)語(yǔ)，其中與不飽和脂肪酸代謝過(guò)程和脂質(zhì)儲(chǔ)存負(fù)調(diào)控關(guān)系最為密切，分別占20.23%和19.21%（圖3B-D）。此外，脂質(zhì)代謝相關(guān)靶基因的KEGG富集分析顯示，它主要與PPAR信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、脂肪分解調(diào)控和鞘脂信號(hào)通路等通路有關(guān)（圖3E）。此外，分析還發(fā)現(xiàn)SIRT1是LA的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分子對(duì)接結(jié)果表明SIRT1蛋白有多個(gè)結(jié)合口袋，能以較低的結(jié)合能與LA穩(wěn)定結(jié)合（圖3F,G）。

圖3

4、LA可改善砷誘發(fā)的肝脂代謝紊亂

為進(jìn)一步驗(yàn)證As的肝毒性機(jī)制和LA的保肝機(jī)制，本研究采用油紅O染色、脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)、RT-PCR和Western印跡法評(píng)估As和/或LA對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響。結(jié)果表明，As暴露20周和32周后，會(huì)明顯促進(jìn)肝臟中總膽固醇（TG）、總膽固醇（T-CHO）和低密度脂蛋白（LDL）的積累，并降低高密度脂蛋白（HDL）的水平（圖4A-D）。與脂質(zhì)檢測(cè)結(jié)果一致，油紅O染色結(jié)果顯示，治療20周和32周后，肝臟中脂質(zhì)（紅色陽(yáng)性區(qū)域）含量和脂滴數(shù)量增加，而LA干預(yù)可顯著降低肝臟脂質(zhì)含量（圖4F）。油紅O染色和肝臟As含量的統(tǒng)計(jì)分析顯示，As暴露后紅色陽(yáng)性面積和肝臟As含量均顯著升高，而LA的干預(yù)能有效緩解這些變化（圖4E、G）。對(duì)關(guān)鍵基因的進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，As暴露會(huì)顯著升高肝臟中P53和Notch1的蛋白表達(dá)水平，而LA干預(yù)能有效降低這兩種蛋白的表達(dá)（圖4H,I）。這些結(jié)果表明，LA，尤其是400mgkg ?1 ，對(duì)緩解As暴露誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂有一定的作用，而這種紊亂是由P53和Notch通路調(diào)控的。

圖4

5、LA可減輕As對(duì)肝臟過(guò)氧物酶體β氧化的抑制作用

用LA干預(yù)后，ATGL、LIPA和ACOX1的mRNA表達(dá)水平顯著增加，而ACACA、FASN和CPT2的mRNA表達(dá)水平則大大低于As組（圖5a）。與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致，ATGL和ACOX1的蛋白表達(dá)水平在As組明顯降低，但在LA干預(yù)后明顯升高（圖5B,C）。線粒體和過(guò)氧化物酶體β氧化是脂質(zhì)分解的核心生物過(guò)程。檢測(cè)結(jié)果表明，As處理明顯降低了乙酰-CoA和mtDNA的含量，而添加LA則有效抵消了這種降低（圖5D,E）。此外，As明顯降低了肝臟中乙酰-CoA合成關(guān)鍵基因（ACSS2和ACLY）的mRNA表達(dá)水平，而LA的干預(yù)則顯著上調(diào)了ACSS2和ACLY的mRNA表達(dá)（圖5F）。此外，如圖5G所示，LA的干預(yù)顯著降低了As誘導(dǎo)的PMP70（過(guò)氧化物酶體表面受體）和PLIN2（脂滴表面受體）蛋白表達(dá)水平的升高。使用PMP70標(biāo)記過(guò)氧物酶體的進(jìn)一步免疫熒光染色顯示，As處理增加了肝臟中的過(guò)氧物酶體，而LA的干預(yù)則有效逆轉(zhuǎn)了這一變化（圖5H），這表明過(guò)氧物酶體β氧化參與了LA緩解As誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積的過(guò)程。

圖5

6、LA可降低As誘導(dǎo)的肝細(xì)胞嗜脂性

采用免疫熒光染色、RT-PCR和Western印跡技術(shù)來(lái)進(jìn)一步探討噬脂在LA介導(dǎo)的改善As引起的肝臟脂質(zhì)沉積中的作用。如圖6A所示，與Ctrl組相比，As組噬脂體的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明噬脂體增加。與Ctrl組相比，As組LC3的mRNA表達(dá)顯著增加，P62的mRNA表達(dá)顯著減少（圖6B）。As組LC3和P62的蛋白表達(dá)量顯著增加，而LA干預(yù)組LC3和P62的蛋白表達(dá)量低于As組，與Ctrl組相比無(wú)顯著差異（圖6C,D）。上述結(jié)果表明，As暴露通過(guò)增加噬脂性誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，而LA可減少噬脂性，減輕肝細(xì)胞損傷。

圖6

7、LA可改善砷誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和脂質(zhì)代謝紊亂，TRCDA可抑制體外過(guò)氧化物酶體β氧化作用

如圖7A和B所示，隨著As濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞的增殖率明顯下降。此外，隨著LA濃度的增加，細(xì)胞的增殖率也相應(yīng)降低。然而，25、50、75和100μmLA的干預(yù)明顯緩解了As處理導(dǎo)致的肝細(xì)胞增殖率下降（69.89%），相應(yīng)的增殖率分別為84.92%、89.29%、89.58%和86.97%（圖7C）?；谏鲜鼋Y(jié)果，本研究確定在后續(xù)的細(xì)胞模型研究中，As的處理濃度為10μmolL ?1 ，LA的處理濃度為25μmolL ?1 ，處理時(shí)間為24h。研究發(fā)現(xiàn)，LA的關(guān)鍵靶蛋白SIRT1被As下調(diào)，而LA能有效上調(diào)SIRT1的表達(dá)，這與體內(nèi)研究結(jié)果一致（圖7D）。而LA的干預(yù)則提高了肝細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平（圖7F,G），這表明LA在細(xì)胞水平上對(duì)改善脂質(zhì)代謝紊亂具有與體內(nèi)觀察到的相似的作用。

ACOX1蛋白檢測(cè)結(jié)果表明，LA干預(yù)增加了ACOX1蛋白的表達(dá)，而As處理降低了ACOX1蛋白的表達(dá)，而TRCDA處理進(jìn)一步降低了ACOX1蛋白在肝細(xì)胞中的表達(dá)（圖7H,I）。這些研究結(jié)果表明，TRCDA抑制了過(guò)氧物酶體β-氧化，而β-氧化與As誘導(dǎo)的肝毒性調(diào)控和LA對(duì)肝臟的保護(hù)作用有關(guān)。

圖7

8、TRCDA促進(jìn)了砷誘發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂和脂肪吞噬，同時(shí)降低了LA改善這兩種情況的效果

采用肝細(xì)胞功能和脂質(zhì)含量指標(biāo)檢測(cè)、熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)氧化物酶體β氧化抑制對(duì)LA改善As誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和脂質(zhì)代謝紊亂的影響。如圖8所示，As處理顯著增加肝細(xì)胞的肝功能指標(biāo)（AST和ALT，圖8A）、脂代謝指標(biāo)（TG和T-CHO，圖8B）、細(xì)胞死亡率（圖8C-E）、ROS含量（圖8D,E）、細(xì)胞外酸化率（ECAR，圖8F）、線粒體膜去極化率（圖8G），但增加了肝細(xì)胞的耗氧率（OCR，圖8F）。

圖8

本研究還從LA改善As誘導(dǎo)的肝損傷的角度研究了過(guò)氧化物酶體β氧化對(duì)噬脂的調(diào)控作用。結(jié)果表明，As處理明顯增加了肝細(xì)胞中噬脂熒光點(diǎn)的強(qiáng)度和數(shù)量，升高了肝細(xì)胞脂滴中LC3、ULK和P62的蛋白表達(dá)水平，降低了肝細(xì)胞脂滴中mTOR的蛋白表達(dá)水平，但LA的干預(yù)緩解了As誘導(dǎo)的上述變化（圖9A-E）。此外，TRCDA處理進(jìn)一步促進(jìn)了As誘導(dǎo)的噬脂相關(guān)指標(biāo)的變化，同時(shí)抑制了LA對(duì)As誘導(dǎo)的噬脂的改善作用（圖9A-E）。這些結(jié)果表明，過(guò)氧物酶體β氧化調(diào)節(jié)噬脂作用，并在LA改善As誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮了重要作用。

圖9

總結(jié)：本文旨在探討α-LA對(duì)As誘導(dǎo)的雞肝脂質(zhì)紊亂的改善作用及其潛在機(jī)制。這篇文章將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)的思路很值得學(xué)習(xí)，很有創(chuàng)新性！如果復(fù)現(xiàn)有困難，可以聯(lián)系我們定制方案，傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！