題目：黃芪郁金通過(guò)HIF-1α調(diào)控腫瘤血管正?；种平Y(jié)腸癌轉(zhuǎn)移

英文名：Astragali Radix-Curcumae Rhizoma normalizes tumor blood vessels by HIF-1α to anti-tumor metastasis in colon cancer

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7

發(fā)表時(shí)間：2025年2月24日

研究背景：腫瘤血管異常通過(guò)加劇缺氧微環(huán)境、抑制免疫功能等方式促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。黃芪（補(bǔ)氣藥）與郁金（活血藥）的組合（AC）具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，但其調(diào)控腫瘤血管正?；臋C(jī)制尚不明確。

研究思路：通過(guò)結(jié)腸癌原位移植小鼠模型，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)（如WB、IF、ELISA等），驗(yàn)證AC通過(guò)靶向HIF-1α抑制糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3，增強(qiáng)血管內(nèi)皮連接，促進(jìn)血管正?；?，最終抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。

圖1

研究結(jié)果：

1、AC對(duì)腫瘤負(fù)荷小鼠腫瘤生長(zhǎng)和肝轉(zhuǎn)移的抑制作用

與模型組（Model）相比，5-Fu組和高劑量AC組（AC-high）的相對(duì)生物發(fā)光強(qiáng)度顯著降低（圖2C,D），表明5-Fu和AC-high能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤體積（圖2E-G）和Ki67染色結(jié)果進(jìn)一步支持了這一結(jié)論，顯示藥物干預(yù)組的腫瘤增殖率顯著降低（圖2H,I）。H&E染色顯示，模型組的腫瘤組織細(xì)胞核密集，而藥物干預(yù)組的腫瘤細(xì)胞分布顯示出壞死區(qū)域，部分細(xì)胞核缺失（圖2J）。

圖2

2、AC對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用

解剖后觀察到肝臟上的白色結(jié)節(jié)，手動(dòng)計(jì)數(shù)確定肝轉(zhuǎn)移的數(shù)量。結(jié)果顯示，模型組小鼠的肝臟顯示出明顯的轉(zhuǎn)移跡象，而5-Fu和AC-high治療后，肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少（圖3A,B）。H&E染色進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)移灶核染色的變化（圖3C）。WB分析顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中MMP9、N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平顯著升高，而AC給藥后這些蛋白的表達(dá)水平降低（圖3D,E）。

圖3

3、AC改善腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)血管正?；?/strong>

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后，腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞（TECs）之間的連接緊密，細(xì)胞間間隙減小，形態(tài)趨于扁平（圖4A）。α-SMA和NG2染色結(jié)果表明，AC干預(yù)后，血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的覆蓋顯著增加。此外，IV型膠原蛋白（Col-IV）的覆蓋也顯著增強(qiáng)，表明基底膜的支持改善（圖4B,C）。如預(yù)期，AC干預(yù)組中腫瘤血管的lectin陽(yáng)性染色面積顯著增加（圖4D,E），且AC干預(yù)顯著減少了周?chē)艿膁extran滲漏，表明血管通透性降低（圖4D,E）。VE-cad在增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞連接中起關(guān)鍵作用，qRT-PCR分析顯示AC干預(yù)后VE-cad表達(dá)增加。WB分析進(jìn)一步評(píng)估了VE-cad在細(xì)胞膜上的分布，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中細(xì)胞膜上的VE-cad表達(dá)水平顯著降低，而AC給藥后VE-cad表達(dá)水平相對(duì)升高（圖4F-H）。

圖4

4、 AC通過(guò)結(jié)合HIF-1α并抑制其核轉(zhuǎn)位來(lái)改善缺氧微環(huán)境

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析表明，AC可能通過(guò)改善缺氧微環(huán)境來(lái)促進(jìn)腫瘤血管正常化。通過(guò)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，研究了AC干預(yù)是否能通過(guò)改善缺氧微環(huán)境來(lái)促進(jìn)腫瘤血管正常化。共鑒定出611個(gè)與結(jié)直腸癌（CRC）相關(guān)的靶點(diǎn)和684個(gè)與AC相關(guān)的靶點(diǎn)。通過(guò)在線工具Venny2.1.0，確定了172個(gè)與AC相關(guān)的抗CRC靶點(diǎn)（圖5a）。這些蛋白的相互作用（PPI）從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，并在Cytoscape3.7.2中構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)（圖5B）。基于“degree”值選擇了前40個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行KEGG富集分析和“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（圖5C）。KEGG分析顯示，主要信號(hào)通路包括PI3K-Akt、FoxO和HIF-1（圖5D,E）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們重點(diǎn)關(guān)注HIF-1α，這是該信號(hào)通路的核心靶點(diǎn)。成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)表明，AC的主要成分通過(guò)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路發(fā)揮作用，包括槲皮素（A2）和山柰酚（A15）（圖5C）。

圖5

5、AC的核心成分與HIF-1α的有效結(jié)合

將重組HIF-1α蛋白固定在葡聚糖傳感器芯片上?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)現(xiàn)，我們選擇了潛在的核心活性成分，如槲皮素和山柰酚，通過(guò)表面等離子共振（SPR）常數(shù)探索它們與HIF-1α的直接相互作用和親和力。結(jié)果顯示，槲皮素和山柰酚可以與HIF-1α直接結(jié)合，KD值分別為4.04×10?和3.39×10?（圖5F）。

6、AC調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)并抑制其核轉(zhuǎn)位，抑制糖酵解

HIF-1α僅在缺氧條件下穩(wěn)定表達(dá)，允許其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄。首先，我們對(duì)腫瘤組織中的HIF-1α進(jìn)行IF染色，以評(píng)估各組腫瘤缺氧的程度。結(jié)果顯示，藥物干預(yù)減少了腫瘤組織中HIF-1α陽(yáng)性區(qū)域的面積，改善了腫瘤的氧合（圖6A,B）。qRT-PCR和WB分析進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖6C,E,H）。進(jìn)一步檢查腫瘤組織中HIF-1α蛋白的核表達(dá)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中HIF-1α的表達(dá)水平顯著升高，而AC給藥后HIF-1α的核表達(dá)水平降低（圖6C,E,H）。HIF-1α誘導(dǎo)多種代謝轉(zhuǎn)化酶，使腫瘤代謝轉(zhuǎn)向糖酵解。PFK-1是糖酵解的主要限速酶，由PFKFB產(chǎn)生的果糖-2,6-二磷酸激活，從而促進(jìn)糖酵解。我們的結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中PFKFB3異常過(guò)表達(dá)，而藥物干預(yù)后其表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖6D,E,G）。我們測(cè)量了果糖-1,6-二磷酸水平，發(fā)現(xiàn)AC-high處理后該水平降低（圖6H）。乳酸的產(chǎn)生是腫瘤細(xì)胞糖酵解率的主要指標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AC干預(yù)組的血清乳酸水平顯著低于模型組（圖6I）。

圖6

7、AC通過(guò)HIF-1α改善缺氧微環(huán)境，延緩腫瘤進(jìn)展

首先通過(guò)腹腔注射HIF-1α穩(wěn)定劑DMOG來(lái)建立有效穩(wěn)定和積累HIF-1α的小鼠模型。為了評(píng)估DMOG的效果，我們對(duì)各組小鼠腫瘤組織中的HIF-1α進(jìn)行了IF染色。結(jié)果顯示，與模型組相比，DMOG處理組中HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)顯著增加。此外，AC和DMOG聯(lián)合干預(yù)后，HIF-1α的陽(yáng)性率顯著降低（圖7H,I）。WB分析進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖7J,K）。我們進(jìn)一步研究了HIF-1α過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，并比較了AC干預(yù)的效果。與模型組相比，DMOG刺激后腫瘤體積和重量增加。此外，在AC和DMOG聯(lián)合組中，腫瘤體積和重量相較于DMOG單獨(dú)組有所減少（圖7C,D）。H&E染色顯示，與DMOG單獨(dú)組相比，AC和DMOG聯(lián)合組的腫瘤細(xì)胞核排列稀疏，顯示出明顯的腫瘤壞死區(qū)域和細(xì)胞核缺失（圖7E）。Ki67IHC染色的結(jié)果與這些發(fā)現(xiàn)一致（圖7F,G）。

圖7

8、AC抑制缺氧誘導(dǎo)的肝轉(zhuǎn)移

與模型組相比，DMOG刺激后的腫瘤顯示出更強(qiáng)的肝轉(zhuǎn)移能力，而AC治療抑制了缺氧誘導(dǎo)的肝轉(zhuǎn)移（圖8A,B）。H&E染色證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（圖8C），表明DMOG處理后腫瘤的肝轉(zhuǎn)移增加。相反，在AC和DMOG聯(lián)合干預(yù)組中，肝轉(zhuǎn)移相較于DMOG單獨(dú)組有所減少。

圖8

9、AC通過(guò)HIF-1α促進(jìn)腫瘤血管正?；⒏纳迫毖跷h(huán)境

AC可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α來(lái)影響腫瘤血管的結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。與模型組相比，DMOG刺激后，血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物αSMA、周細(xì)胞標(biāo)記物NG2和基底膜標(biāo)記物Col-IV的水平顯著降低。此外，與DMOG單獨(dú)組相比，AC和DMOG聯(lián)合治療組中血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞和基底膜的覆蓋顯著增強(qiáng)（圖9A,B）。dextran滲漏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，DMOG建模后dextran外滲面積增加。重要的是，AC似乎恢復(fù)了HIF-1α過(guò)表達(dá)小鼠的血管通透性，從而抑制了滲漏（圖9C,D）。此外，lectin灌注結(jié)果顯示，與DMOG單獨(dú)組相比，AC和DMOG聯(lián)合組中l(wèi)ectin陽(yáng)性信號(hào)面積增加，表明AC逆轉(zhuǎn)了HIF-1α過(guò)表達(dá)的影響，并改善了這些小鼠的血液灌注（圖9C,D）。

圖9

10、AC通過(guò)HIF-1α抑制糖酵解，促進(jìn)腫瘤血管正常化

AC可能通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α和抑制糖酵解來(lái)影響腫瘤血管的重塑。觀察結(jié)果顯示，AC和DMOG聯(lián)合組中PFKFB3的表達(dá)顯著低于DMOG單獨(dú)組（圖9E-G）。此外，與DMOG單獨(dú)組相比，AC和DMOG聯(lián)合組中VE-cadherin的表達(dá)增加（圖9E,G）。我們還注意到，HIF-1α的表達(dá)增加伴隨著果糖-6-二磷酸濃度的相應(yīng)增加。值得注意的是，AC降低了果糖-6-二磷酸濃度，AC和DMOG聯(lián)合組相較于DMOG單獨(dú)組果糖-6-二磷酸濃度顯著降低（圖9H）。

總結(jié)：本研究發(fā)現(xiàn)AC通過(guò)抑制HIF-1α核轉(zhuǎn)位，下調(diào)PFKFB3減少糖酵解，增強(qiáng)血管內(nèi)皮連接蛋白VE-cad表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管結(jié)構(gòu)功能正?；纳迫毖跷h(huán)境，抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)與肝轉(zhuǎn)移。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實(shí)驗(yàn)方案、完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專(zhuān)屬服務(wù)為您排憂(yōu)解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！