題目：新型系統(tǒng)生物學(xué)實驗流水線揭示了羅漢松樹脂素在前列腺癌中的抗轉(zhuǎn)移潛力：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)和實驗驗證的綜合方法

英文名：Novel systems biology experimental pipeline reveals matairesinol’s antimetastatic potential in prostate cancer: an integrated approach of network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation

雜志：Briefings in Bioinformatics

影響因子：Q1/6.8

發(fā)表時間：2024年9月5號

研究背景：羅漢松樹脂素（MAT）是一種植物木質(zhì)素，因其在乳腺癌和前列腺癌等激素敏感性癌癥中的抗癌特性而聞名，在治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌（mPC）方面提供了一條有前景但未被充分開發(fā)的途徑。

研究思路：為了闡明其特定的治療靶點和機制，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（NP）、生物信息學(xué)、基于基因MANIA的功能關(guān)聯(lián)（GMFA）和實驗驗證融為一體研究方法。通過挖掘在線數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了27個mPC和MAT的共同靶點，通過STRING構(gòu)建了MAT-mPC蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用CytoHuba確定了11個中心靶點，如EGFR、AKT1、ERBB2、MET、IGF1、CASP3、HSP90AA1、HIF1A、MMP2、HGF和MMP9。利用DAVID，GO分析強調(diào)了轉(zhuǎn)移相關(guān)過程，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞遷移的正調(diào)控，以及關(guān)鍵的KEGG通路分析，包括癌癥、前列腺癌、PI3K-Akt和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而UALCAN和GEPIA2等數(shù)據(jù)庫鑒定了前11個中心靶點在mPC患者生存分析和基因表達模式中的臨床意義。運用一種新的富集方法（GMFA）進一步豐富了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果。分子對接分析表明了MAT與11個中心靶點之間的實質(zhì)性相互作用。模擬研究證實了MAT與選定靶點的穩(wěn)定相互作用。利用RT-qPCR和各種基于細胞的檢測方法在PC3細胞中進行的實驗驗證證實了MAT對mPC的抗轉(zhuǎn)移作用?？偟膩碚f，進行了詳盡的NP分析，輔以GMFA、分子對接、分子動力學(xué)模擬和實驗驗證，強調(diào)了MAT在通過不同治療途徑靶向mPC方面的多方面作用。

研究結(jié)果：

1、構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并分析MAT針對mPC的前11個樞紐目標

采用了一種系統(tǒng)方法來預(yù)測針對mPC的MAT靶點。首先，從Swiss Target Prediction、Pharmapper和Superpred數(shù)據(jù)庫中檢索了MAT靶點，得出了524個潛在靶點。同時，還從GeneCards和DisGeNet數(shù)據(jù)庫中確定了mPC靶點，得出了236個靶點。交叉分析發(fā)現(xiàn)了MAT針對mPC的27個潛在治療靶點（PTM-mPC）（圖1A）。PPI網(wǎng)絡(luò)包括27個從mPC和MAT基因交叉點識別出的PTM-mPC中心靶標（圖1B）。該網(wǎng)絡(luò)有27個節(jié)點，163條邊，平均PPI富集P值小于1.0e-16，平均局部聚類系數(shù)為0.75，平均節(jié)點度為12.1。通過CytoHubba插件，Cytoscape分析進一步確定了前11個基因--EGFR、AKT1、ERBB2、MET、IGF1、CASP3、HSP90AA1、HIF1A、MMP2、HGF和MMP9（圖1C），這些基因按其程度算法得分排序，用顏色表示節(jié)點程度。

圖1

2、通路的富集分析和MAT靶向mPC的預(yù)測靶標的C-T-P網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用DAVID分析了KEGG通路中的27條共同路徑，以了解MAT誘導(dǎo)的mPC進展改變。發(fā)現(xiàn)了36條通路（FDR≤0.05，P值≤0.05），前20條通路見圖2A。構(gòu)建了一個“化合物-靶點-通路（C-T-P）”網(wǎng)絡(luò)（圖2B），以直觀顯示MAT、其目標和相關(guān)通路。值得注意的通路包括：癌癥中的通路、癌癥中的原茶聚糖、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、前列腺癌和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抗性。前列腺癌與8個基因密切相關(guān)，包括GSK3B、HSP90AA1、ERBB2、AKT1、IGF1、MMP9、表皮生長因子受體、和表皮生長因子受體2在C-T-P網(wǎng)絡(luò)中的作用，突顯了MAT與癌癥相關(guān)信號級聯(lián)之間的潛在聯(lián)系。利用DAVID進行的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，150個BP、20個CC和35個MF術(shù)語的P值達到了≤0.05閾值。應(yīng)用FDR過濾器（FDR≤0.05）得到34個BP項、3個CC項和16個MF項。圖2C顯示了前15個BP和MF術(shù)語以及3個CC術(shù)語。BP富集包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、細胞增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等通路。CC術(shù)語表明基因存在于細胞膜和細胞外空間等細胞區(qū)域。MF分析顯示了一些關(guān)鍵功能，如如蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合和激酶活性。這項分析加深了人們對MAT對mPC治療作用的了解。

圖2

3、基因表達模式比較分析，重點關(guān)注MAT在正常組織和腫瘤組織中針對mPC的前11個樞紐靶點

利用UALCAN等公開數(shù)據(jù)集對前列腺腺癌患者的前11個樞紐靶點進行了基因表達分析。與正常組織相比，MMP-9、AKT1和CASP3在原發(fā)性腫瘤、高Gleason評分（6-10分）和轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)中的表達明顯增加。此外，隨著格里森評分的升高，AKT1、ERBB2、HSP90AA1和MMP9的表達也呈上升趨勢，盡管AKT1和ERBB2在格里森評分為10時的表達有所下降（圖3）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了樞紐靶點在不同前列腺腺癌進展階段的不同表達模式。

圖3

4、前列腺腺癌前11個樞紐基因的存活率分析：對患者預(yù)后和治療策略的影響

生存圖分析評估基因表達模式和患者生存結(jié)果，這對預(yù)后和治療策略至關(guān)重要。利用GEPIA2分析了前11個樞紐靶點的OS和無復(fù)發(fā)生存（RFS）概率（圖4）。生成中位數(shù)截斷值為50%且風(fēng)險比為95%置信區(qū)間的圖。值得注意的是，在RFS分析中，HSP90AA1、MMP2、AKT1、CASP3和ERBB2的生存率隨著時間的延長而降低。相反，隨著前列腺癌的進展，HIF1A、HSP90AA1、AKT1、MMP9和ERBB2表達的升高會顯著降低總生存率。這些研究結(jié)果表明，中樞基因表達水平對前列腺癌患者的生存結(jié)果有重大影響。

圖4

5、MAT針對mPC的前11個樞紐靶標的分子對接和分子動力學(xué)模擬研究

通過分子對接，探索了MAT與前11個mPC靶點的相互作用，以了解它們的結(jié)合親和力和治療意義。觀察到MAT與ERBB2（-8.6）、AKT1（-8.5）、MMP-9（-8.4）、MET（-7.8）和表皮生長因子受體（EGFR）（-7.6）的結(jié)合能值較低，表明其具有較強的親和力。值得注意的是，MAT與酪氨酸激酶膜受體ERBB2、表皮生長因子受體EGFR和MET有很高的親和力，這表明它可能會抑制酪氨酸激酶的活性。此外，MAT與HSP90AA1和MMP-2的結(jié)合能分別為-7.1和-5.5 kcal/mol（圖5）。由于沒有合適的PDBID用于抑制位點的共晶體結(jié)合，作者進行了與IGF1R和MET（IGF1和HGF生長因子的受體）的對接分析。此外，還進行了MAT與CASP3的抑制劑XIAP的對接，以研究MAT對CASP3激活的可能調(diào)節(jié)作用，考慮到缺乏支持CASP3激活位點的合適PDBID，對接結(jié)合能（-6.1）。

圖5

根據(jù)它們在 mPC 中的結(jié)合親和力和生物學(xué)相關(guān)性，前5個樞紐靶標ERBB2、AKT1、MMP9、MET和EGFR進行MD模擬（圖6）。RMSD分析表明，與ERBB2-CL復(fù)合物（平均RMSD：0.5nm）相比，ERBB2-MAT復(fù)合物（平均RMSD：0.3nm）具有更好的穩(wěn)定性。RMSF分析表明，MAT結(jié)合的ERBB2波動較小。ERBB2-MAT復(fù)合物的Rg保持穩(wěn)定~2nm。AKT1-MAT。在50ns之前，RMSD比較穩(wěn)定，但之后就出現(xiàn)了偏差。RMSF在AKT1-MAT的N端結(jié)構(gòu)域波動較大。AKT1-MAT的Rg穩(wěn)定在2.2nm。MMP9復(fù)合物顯示出相似的RMSDRMSF，Rg穩(wěn)定在1.525nm。與MET-CL相比，MET-MAT的RMSD稍低，RMSF和穩(wěn)定Rg相似。表皮生長因子受體復(fù)合物的RMSD和RMSF較高，穩(wěn)定的Rg~2.2nm。CL與表皮生長因子受體形成了三個穩(wěn)定的氫鍵，而MAT則偶爾形成氫鍵。

圖6

6、基于GeneMANIA的MAT針對mPC的前11個樞紐靶標的功能關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

作者利用他們之前建立的GeneMANIA分析方法，擴展了前11個中心目標基因列表，確定了每個中心靶點增加10個基因（圖7），從而形成GMFA擴展數(shù)據(jù)（GMFA-ED）。去除重復(fù)基因后，該數(shù)據(jù)集由112個基因組成，有助于進行全面的基因-基因相互作用分析。GMFA方法整合了共表達、遺傳相互作用和物理相互作用參數(shù)，以捕捉與疾病過程相關(guān)的各種基因。GMFA-ED在隨后的GO和KEGG富集分析中發(fā)揮了重要作用，為探索與已識別基因相關(guān)的功能意義奠定了堅實的基礎(chǔ)。

圖7

7、GO和KEGG富集分析、C-T-P網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及與MAT和mPC相關(guān)的GMFA-ED富集比較分析

GMFA-ED數(shù)據(jù)集揭示了一個擴展的基因網(wǎng)絡(luò)，其中包括112個基因，形成了一個功能基因網(wǎng)絡(luò)（FGN）（圖8A）。使用DAVID對基因本體論和通路進行了分析。數(shù)據(jù)庫揭示了BP的顯著富集，包括對mPC進展至關(guān)重要的通路，如蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、表皮生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ERK1和ERK2級聯(lián)調(diào)控以及細胞遷移。此外，與質(zhì)膜相關(guān)的富集CC基底外側(cè)質(zhì)膜和基底質(zhì)膜等蛋白，強調(diào)了它們在癌癥轉(zhuǎn)移中的相關(guān)性。經(jīng)GMFA-ED分析后富集的中頻蛋白表明，它們與生長因子受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，包括蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸、生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、胰島素樣生長因子結(jié)合和胰島素樣生長因子結(jié)合（圖8B）。基因組學(xué)分析后的KEGG通路分析顯示了mPC相關(guān)信號的豐富性，突出了癌癥中的HIF1A、ErbB、FOXO和微陣列等通路。PI3K/Akt信號顯示了廣泛的富集，強調(diào)了關(guān)鍵的參與者與GMFA-ED分析前相比AT-Targets-Pathways網(wǎng)絡(luò)顯示了顯著的相互作用（圖8C）。利用來自GMFA-ED的前20個信號通路構(gòu)建的MAT-靶標-通路網(wǎng)絡(luò)揭示了顯著的相互作用（圖8C）。該網(wǎng)絡(luò)有82個節(jié)點（MAT、61個靶標和20個通路）和392條邊、表明MAT通過關(guān)鍵信號通路中的各種靶點明顯參與（圖8D），包括癌癥中的通路、PI3K/Akt通路、癌癥中的蛋白聚糖、MAPK信號通路，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了這些通路在介導(dǎo)MAT對mPC的抗轉(zhuǎn)移治療效果方面的共同作用。

圖8

圖9展示了GMFA實施前后GO和KEGG富集分析的直觀對比（PTM-mPC與GMFA-ED）。GMFA-ED的GO和KEGG富集分析揭示了與MAT對抗mPC的潛在靶點相關(guān)的BP、CC和MF的全面富集情況。與最初的樞紐靶標（PTM-mPC）富集相比，這些富集更為相關(guān)，有助于深入了解MAT在mPC中潛在抗轉(zhuǎn)移作用的復(fù)雜分子機制。在前列腺癌方面，GMFA-ED富集后的KEGG通路分析確定了PI3K-Akt信號通路中基因的大量富集。值得注意的是，這種富集包括六個基因：GF、GFR、PI3K、Grb2、PTEN和Akt。需要強調(diào)的是在對PTM-mPC的初步分析中，除了GF、GFR和Akt外，沒有觀察到MAT的富集作用，而GF、GFR和Akt先前已被確定為MAT的靶點。這強調(diào)了通過GMFA-ED分析在揭示PI3K-Akt信號通路參與MAT對前列腺癌的潛在抗轉(zhuǎn)移作用方面所獲得的更強、更具體的見解（圖10）。

圖9

圖10

8、MAT預(yù)測的PI3K/AKT信號通路靶標的分子對接和分子動力學(xué)模擬研究

作者選擇了在mPC中起關(guān)鍵作用的PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵成分進行全面的分子對接和模擬研究。由IGF1、HGF和EGF等生長因子引發(fā)的PI3K信號激活會導(dǎo)致AKT驅(qū)動級聯(lián)的下游激活。MAT對PI3K/Akt通路中的成分具有顯著的親和力（圖11），顯示出較低的親和力。與IGF1R（-8.1 kcal/mol）、PI3KCA（-7.5 kcal/-mol）、PTEN（-7.1 kcal/mol）和AKT1的結(jié)合能。值得注意的是，PI3K/AKT信號通路中的其他靶點先前也進行了分子對接和MD模擬研究，這是PTM-mPC確定的前10個中心靶點分析的一部分。對接研究中的前三個復(fù)合物進行了MD模擬。PI3KCA主干原子的RMSD分析表明，與PI3KCA-CL復(fù)合物相比，PI3KCA-MAT復(fù)合物的平均RMSD略高于PI3KCA-CL（圖12）。RMSF分析表明，兩種復(fù)合物中環(huán)路區(qū)域（250-500）內(nèi)殘基的側(cè)鏈原子都有明顯波動。MAT始終形成5個一致的氫鍵，而CL形成3個氫鍵，偶爾達到maximum值5個。就IGF1R復(fù)合物而言，IGF1R-MAT復(fù)合物的RMSD偏差很大，而IGF1RCL復(fù)合物的RMSD保持穩(wěn)定，但略微偏高。兩者的RMSF除了末端殘基和殘基~950-1000。兩種復(fù)合物的Rg最初都有偏差，穩(wěn)定在2.5nm左右。MAT形成了4個穩(wěn)定的氫鍵，而CL在最初10毫微秒內(nèi)最多形成5個氫鍵，之后偶爾形成2個氫鍵。在PTEN復(fù)合物中，RMSD在50ns后趨于穩(wěn)定，平均為0.3nm，側(cè)鏈原子的波動與apo和PTEN-MAT復(fù)合物相似。Rg在最初出現(xiàn)偏差后穩(wěn)定在2.25nm，MAT在整個過程中偶爾形成2個氫鍵。

圖11

圖12

9、MAT對PC3細胞具有抗癌活性，抑制了PC3細胞的克隆生成能力

MAT對PC3細胞的抗增殖作用是在24、48和72小時內(nèi)通過MTT試驗進行評估的（圖13A）。在特定時間間隔（24、48和72小時）內(nèi)，MAT處理后細胞存活率的降低呈劑量依賴性，這證實了MAT對轉(zhuǎn)移性PC3前列腺癌細胞的抗癌潛力。細胞克隆形成實驗表明，MAT抑制了PC3細胞的克隆生成能力，MAT的影響可直觀地顯示出來（圖13B），隨著MAT濃度的增加，細胞集落和細胞數(shù)量減少（圖13C）。定量分析顯示，克隆生成性的降低與劑量有關(guān)，MAT劑量為50μM（1.196倍）、100μM（1.44倍）和200μM（2.097倍）時，克隆生成性顯著降低（圖13D）。

圖13

10、MAT可抑制PC3前列腺癌細胞的遷移，減少基于肌動蛋白的片層和絲狀細胞的形成

傷口愈合試驗評估了PC3細胞的遷移，結(jié)果表明MAT處理對細胞遷移的抑制作用呈劑量依賴性（圖14A）。相比之下，50、100和200μM的MAT處理可抑制遷移，使開放傷口面積百分比達到10.99%、經(jīng)ImageJ軟件分析量化，分別為24.48%和71.33%。位于細胞表面的富含肌動蛋白的結(jié)構(gòu)（即絲狀體和片狀體）通過促進ECM重塑，在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)協(xié)調(diào)著細胞的運動和侵襲，對癌癥的轉(zhuǎn)移級聯(lián)起著重要作用。TRITC-鬼筆環(huán)肽染色實驗表明，在MAT處理24小時后，絲狀突起和片狀突起的形成明顯減少，且呈劑量依賴性（圖14B）。

圖14

11、通過qPCR分析，MAT在mRNA水平下調(diào)了樞紐靶標

MAT處理明顯改變了PC3細胞中關(guān)鍵基因的mRNA表達水平（圖15）。值得注意的是，MAT降低了AKT1、ERBB2、MMP2、MMP9、HSP90AA1、HIF1A和IGF1R的mRNA水平、同時增加了PTEN的表達，PTEN是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子。表皮生長因子受體和METmRNA水平基本不受影響。這些研究結(jié)果支持MAT靶向酪氨酸激酶受體，尤其是ERBB2和IGF1R，并調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，表明它對MMP相關(guān)轉(zhuǎn)移性前列腺癌具有潛在療效。

圖15

總結(jié)：本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+分子對接+分子動力學(xué)模擬+細胞實驗驗證，篩選了MAT針對mPC的治療靶點，闡明了它們在MAT抗mPC轉(zhuǎn)移潛能中的作用，思路清晰，傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗證、機制研究服務(wù)，一對一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對畢業(yè)和晉升！