題目：單細胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示轉(zhuǎn)移性腎細胞癌的異質(zhì)性以及抗血管生成療法對胰腺轉(zhuǎn)移病灶的影響

英文名：Single-cell RNA-seq reveals heterogeneity in metastatic renal cell carcinoma and effect of anti-angiogenesis therapy in the pancreas metastatic lesion

雜志：Cancer Letters

影響因子：9.1

發(fā)表時間：2024年8月

研究背景：透明細胞腎細胞癌(ccRCC)是腎細胞癌(RCC)中最常見的亞型，具有向身體各部位轉(zhuǎn)移的傾向，與其他器官轉(zhuǎn)移相比，腎細胞癌胰腺轉(zhuǎn)移(RCCpm)患者的預(yù)后相對更好。通過單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能解析轉(zhuǎn)移性透明細胞腎細胞癌的異質(zhì)性腫瘤微環(huán)境(TME)，揭示TME對治療反應(yīng)和臨床結(jié)果的影響。

研究思路：分析單細胞RNA-seq原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病灶數(shù)據(jù)，以破譯不同的轉(zhuǎn)移TME，解碼胰腺轉(zhuǎn)移的缺氧和炎性TME。first報道了RCCpm樣本的單細胞RNA-seq結(jié)果，對RCCpm TME進行了剖析。然后，結(jié)合其他原發(fā)性RCC和RCC骨轉(zhuǎn)移(RCCbm)樣本，對mRCC TME進行了圖譜分析，揭示了各細胞組分的異質(zhì)性功能及其內(nèi)在特征。然后，基于機器學(xué)習(xí)的生成模型與TCGA數(shù)據(jù)庫和實驗細胞系敏感性數(shù)據(jù)一起用于預(yù)測RCCpm樣本的藥物反應(yīng)。同時還驗證了舒尼替尼等抗血管生成治療的效果。

研究結(jié)果：

1、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性RCC樣本分析：TME成分和功能的變化

為了研究RCC患者體內(nèi)TME的異質(zhì)性，選用手術(shù)切除后無轉(zhuǎn)移的原發(fā)性RCC樣本(n=3)、有多處轉(zhuǎn)移的原發(fā)性RCC樣本(n=3)、原發(fā)性骨轉(zhuǎn)移樣本(RCCbm，n=3)、腎臟細胞癌胰腺轉(zhuǎn)移(RCCpm，n=3)。并對其中一個樣本送公司進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，對所有RCC樣本進行整合、去批次效應(yīng)分析(圖1A)。得到60983個細胞和25280個基因被用于下游分析。隨后進行了細胞注釋鑒定(圖1B和C)，基于表達模式，大致確定了8種細胞類型(B細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、肥大細胞、骨髓細胞、中性粒細胞、T細胞)(圖1C)。T細胞和髓系細胞的比例很高，上皮細胞和B細胞很少被捕獲，這表明腫瘤內(nèi)的免疫環(huán)境非常活躍。

此外，在UMAP還原中對樣本進行了單獨分析，結(jié)果顯示出相當大的異質(zhì)性(圖1D和E)。同時，RCCbm樣本中的細胞比其他部位的樣本少(圖1E)。隨后計算了每種細胞類型中轉(zhuǎn)移樣本和原發(fā)性RCC樣本的不同表達基因(DEGs)(圖1F)。研究發(fā)現(xiàn)，一些功能基因如CD8A、S100A8/9在轉(zhuǎn)移樣本中上調(diào)。同時，還發(fā)現(xiàn)了幾種細胞類型的功能轉(zhuǎn)換，例如，成纖維細胞中MMP13和CXCL12的上調(diào)與轉(zhuǎn)移性TME中細胞外基質(zhì)建模和炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

圖1

2、RCCpm TME經(jīng)歷了新陳代謝重編程，并改變了生物合成

為了分析RCCpm TME的細胞成分，將10890個細胞，基于標記基因進行注釋(圖2A和B)。在RCCpm樣本中未發(fā)現(xiàn)胰腺星狀細胞和內(nèi)分泌細胞，這表明RCCpm TME與胰腺導(dǎo)管腺癌等常見胰腺癌相比具有很大的異質(zhì)性。同時，計算每種細胞類型的比例，也與胰腺癌明顯不同，上皮細胞(7415個，68.09%)最多，其次是T細胞(1192個，68.09%)。但很少發(fā)現(xiàn)成纖維細胞(TME的10890個細胞中有476個成纖維細胞，占4.37%)(圖2A)。通過IHC染色證實了RCCpm，與配對的正常胰腺組織相比，巨噬細胞在RCCpmTME中富集，以SMA標記的成纖維細胞較少且雜亂無章(圖2C)。

作者進一步研究了RCCpm TME中細胞的核型。幾乎所有的非整倍體細胞都出現(xiàn)在上皮細胞中，這些細胞被認為是高度惡性細胞，而其他二倍體上皮細胞則被定義為低惡性潛能細胞或正在發(fā)生癌變的上皮細胞(圖2D)。計算了非整倍體上皮細胞與其他上皮細胞的不同表達基因(DEGs)。隨后，DEGs的基因功能富集結(jié)果顯示，其變化主要集中在能量代謝(ATP代謝過程、有氧呼吸等)、蛋白質(zhì)合成(細胞質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等)和細胞粘附(病灶粘附、細胞-基質(zhì)連接和粘附素結(jié)合等)方面(圖2E)。所有這些功能變化都與腫瘤的進展密切相關(guān)，表明RCCpm TME具有活躍的侵襲性。

總之，與原發(fā)性RCC、RCCbm和原發(fā)性胰腺癌相比，RCCpm TME表現(xiàn)出與氧相關(guān)的代謝重編程、細胞粘附性改變和蛋白質(zhì)合成活躍等明顯特征。

圖2

3、PAX8-myc信號在上皮細胞中上調(diào)，導(dǎo)致缺氧和炎癥性TME

對所有上皮細胞集群進行了分組和重新分析，發(fā)現(xiàn)了四個不同的集群(圖3A)。作為RCC的標記基因，NDUFA4L2被證實在腫瘤細胞中廣泛表達，而上皮細胞幾乎沒有表達CFTR，CFTR是原發(fā)性胰腺癌細胞和胰腺上皮細胞的標記基因。因此，進一步確定了RCCpm病變既不同于胰腺組織，也不同于原發(fā)性胰腺癌(圖3B)。此外，當檢索上皮細胞的拷貝數(shù)分析時，發(fā)現(xiàn)NDUFA4L2的表達與核型和基因組的穩(wěn)定性相關(guān)(圖3C)。非整倍體細胞中NDUFA4L2的表達明顯高于二倍體細胞，這證實了非整倍體細胞的高度惡性。同時，為了在組織學(xué)水平上確認RCCpm，對RCCpm組織進行了CA9、CD10和CK7染色(圖3D)。CA9和CD10在大多數(shù)ccRCC細胞中都有表達，而CK7在ccRCC中則呈顯性陰性。

作者將第1組上皮細胞作為參照，因為它們的核細胞相對穩(wěn)定，腫瘤基因表達量較低。計算了與其他上皮細胞相比的DEGs，并根據(jù)腫瘤特征進行了基因組富集分析(GSEA)。在上皮細胞群1中，通過NF-κB和P53通路的TNFα信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上調(diào)，而氧化磷酸化、myc靶點和活性氧(ROS)通路則反向下調(diào)(圖3E)。這些通路表明，上皮簇1可能是腫瘤前期細胞的中轉(zhuǎn)站，但不會發(fā)展為惡性細胞。與上皮細胞簇1相比，GSEA分析還分別應(yīng)用于其他三個上皮細胞簇，結(jié)果一致顯示myc靶點和氧化磷酸化通路顯著上調(diào)(圖3E)。

同時，還引入了RNA速度矩陣來區(qū)分核細胞依賴的發(fā)育方式。RNA速度被可視化并按核細胞分組(圖3I)。上皮簇2有形成簇的趨勢，分析了每個上皮簇中的DEGs，并觀察了從上皮簇1到上皮簇的進展趨勢(圖3F)。有研究證實，myc信號在腎癌中通過關(guān)鍵介質(zhì)PAX8與CCND1、HNF1B和HIF2A相互影響和調(diào)控。因此，檢測了這些MYC信號相關(guān)基因的表達，證實這些基因在惡性細胞簇中上調(diào)(圖3G)。此外，對兩個先前診斷的RCCpm樣本(共三個樣本)進行了IHC檢測。結(jié)果顯示，與正常胰腺相比，PAX8在RCCpm樣本中上調(diào)(圖3H)。這間接證實了PAX8-MYC通路在RCCpm中起著至關(guān)重要的作用。

總之，通過上皮細胞的表達模式和生物學(xué)功能，確定了四個不同的上皮細胞群。在惡性細胞中，Myc通路和氧化磷酸化通路得到強調(diào)，代謝重編程被解讀為缺氧和炎癥環(huán)境以及激活的糖酵解和脂肪酸代謝。

圖3

4、RCCpm TME表現(xiàn)出活躍的免疫反應(yīng)，內(nèi)皮細胞是核心細胞

RCCpm TME中的細胞類型也不盡相同，因此，研究了其他細胞成分的重塑及其對腫瘤進展的影響。并根據(jù)其表達模式確定了免疫細胞的六種細胞類型(圖4A和B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞等髓系細胞表達了大量細胞因子，如IL1B、CXCL2和CXCL12，它們不僅激活了先天性免疫，還誘導(dǎo)了T細胞的活化。同時，大多數(shù)T細胞為幼稚T細胞，CD8+T細胞表達顆粒酶(GZMK)，表現(xiàn)出活躍的細胞毒性殺傷功能，但胰腺癌中浸潤的大多數(shù)T細胞已衰竭。此外，幾乎沒有檢測到B細胞，這可能是由于個體差異或測序偏差造成的。

細胞-細胞互作分析發(fā)現(xiàn)Epi0Ribo、成纖維細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞在TME中比其他集群更活躍(圖4C)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞的傳入信號模式包括VEGF、PECAM1、SELL、CDH5和GDF，傳出信號包括APP、PECAM1、CDH5和PDGF(圖4D-E)。

總之，RCCpm TME顯示出活躍的免疫反應(yīng)，而內(nèi)皮細胞是與大噬菌體和CD8+T細胞積極交流的核心角色。

圖4

5、舒尼替尼被證實是治療RCCpm的有效方法

TKIs是RCC和mRCC的一線治療方案之一。對于mRCC，TKIs的療效可能并不亞于細胞切除腎切除術(shù)。內(nèi)皮細胞在RCCpm TME中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，接下來分析了RCCpm樣品的潛在藥敏性。由于單細胞RCCpm數(shù)據(jù)和大約五百個TCGA樣本之間的樣本數(shù)量存在偏差，使用了基于機器學(xué)習(xí)的生成模型來生成具有相似表達模式的RCCpm批量RNA-seq數(shù)據(jù)。首先對RCCpm樣本和TCGA樣本中的上皮細胞進行了子集，并對藥物敏感性進行了預(yù)測。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)一線治療藥物被認為是耐藥的。然后，作者將所有單細胞數(shù)據(jù)作為機器學(xué)習(xí)模型的輸入，并生成了可以剖析整個RCCpm TME的新樣本。結(jié)果顯示，大多數(shù)酪氨酸激酶抑制劑對RCCpm樣本都有效，包括上述指南推薦作為可選一線靶向療法的舒尼替尼在內(nèi)(圖5)。所有這些結(jié)果都證明了內(nèi)皮細胞在RCCpm TME中的關(guān)鍵作用，并證實了作者的假設(shè)，即異質(zhì)性轉(zhuǎn)移性RCC TME會導(dǎo)致不同的生物學(xué)特征和治療反應(yīng)。

圖5

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