一、實驗原理

細(xì)胞活力檢測試劑盒(CCK-8) 可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。

其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于測定細(xì)胞增殖或毒性實驗中活細(xì)胞數(shù)目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法,可替代傳統(tǒng)的MTT法。

二、用途

藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。

三、優(yōu)點

· 使用方便，無需洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；

· CCK-8法能快速檢測；

· CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；

· CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法，產(chǎn)生的formazan 是水溶性的，減少因洗滌和溶解帶來的誤差；

· CCK-8法對細(xì)胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

· CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑無需預(yù)制，即開即用。

四、實驗操作指南

1．96孔板每孔加入細(xì)胞100 μL（留2個空白組不加細(xì)胞，加入同體積的培養(yǎng)基）。細(xì)胞置于37°C的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

注：A、通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100 μL約含2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100 μL約含5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。

B、培養(yǎng)溫度與細(xì)胞類型有關(guān)，一般哺乳動物細(xì)胞建議37°C，其他種屬根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)條件選擇合適的溫度。

2．每孔加入10 μL不同濃度的藥物刺激激（1 中加了細(xì)胞的，留 2 個對照組不加藥物，加 入同體積的培養(yǎng)基）。

3．將96孔板在37°C，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

注：同上。根據(jù)不同實驗細(xì)胞需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤龡l件和時間。

4．每孔加入10 μL的CCK-8溶液。37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1~4 h。

注：同上。根據(jù)不同實驗細(xì)胞需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤龡l件和時間。

5．酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

6．如果暫時不測定OD值，可向每孔中加入10 μL 0.1 M HCl溶液或者1%（W/V）SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光室溫保存。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

7．結(jié)果分析：

A．細(xì)胞存活率：將各測試孔的OD值減去本底OD值（空白組），各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)±SD。

細(xì)胞存活率% =(加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD)×100%。

B．求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)。

五、經(jīng)驗總結(jié)

1．種板數(shù)：通過文獻(xiàn)確認(rèn)，看實驗所用細(xì)胞別人是否做過，找出大致范圍。稀釋一系列濃度種板。

觀察多長時間細(xì)胞可貼壁完全，一般貼壁生長24小時。在實驗時間內(nèi)，觀察不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長情況。在擬定的時間內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長？

因為每塊板都需設(shè)置對照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入CCK8，這個數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試驗最佳OD值在1.0附近。不要讓細(xì)胞長滿，其一，會對藥物順利進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生影響此，其二生長不均勻易導(dǎo)致孔間OD值數(shù)據(jù)偏差大。

2．貼壁生長的時間一般設(shè)置貼壁24h，這個時間一般細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全，且對安排實驗時間也方便。

3．加藥后的孵育時間，設(shè)置時間梯度，根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇最好的時間。

4．接種時注意細(xì)胞懸液一定要混勻，以避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接種數(shù)孔即混勻一下。培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)基容易揮發(fā)，為了減少誤差，建議培養(yǎng)板的四邊每孔只加培養(yǎng)基或無菌PBS，而不作為指標(biāo)檢測孔。

5．CCK8試劑加入量，按照說明書的體系加入合適的CCK-8的含量如細(xì)胞體系較大，適當(dāng)增加CCK-8的量。

6．CCk8試劑加入后孵育時間，隨著時間的增加，OD值就會增大。CCK- 8的最佳反應(yīng)時間以具體顯色的最佳時間為準(zhǔn)。第一次做實驗時，建議先做數(shù)孔摸索接種細(xì)胞的最佳數(shù)量和加入CCK-8試劑后的最佳孵育時間。一般情況下，白細(xì)胞較難顯色，因此需要較長的CCK- 8反應(yīng)時間或增加細(xì)胞數(shù)量 (～105個細(xì)胞/孔)。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色。對于懸浮細(xì)胞，在加入CCK- 8孵育1- 4小時后，可先從培養(yǎng)箱中取出，目測染色程度或用酶標(biāo)儀測定決定CCK- 8最佳孵育時間。若顯色困難，可將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時后再測定。對于貼壁細(xì)胞，CCK- 8的孵育時間一般為1- 4小時，多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)30分鐘左右即可肉眼觀察到明顯的顯色反應(yīng)，培養(yǎng)3.5-4小時左右檢測效果最佳?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。

7．實驗時盡量多設(shè)置復(fù)孔，取平均值。實驗時把OD值控制在1.0左右。因人為造成的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定只能通過增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來彌補。另外實驗操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。

8．CCK-8的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設(shè)法去除。含有酚紅的培養(yǎng)基不影響本試劑盒做細(xì)胞活性的測定。

9．如何判定待測溶液是否有還原性？不含細(xì)胞的待測溶液孔中加入CCK-8溶液10 μL，孵育1-4小時，測定在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，說明待檢測體系中存在較少的還原劑，正式檢測時即可直接加入CCK-8 ；如果該吸光度相對較大，說明待檢測體系中存在較多的還原劑，正式檢測時則需要除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基和10 μL CCK-8進(jìn)行檢測。

10．如果樣品為高渾濁度的細(xì)胞懸液，建議設(shè)定600 nm (或600 nm以上) 作為參比波長，扣除參比波長的O.D值即可。