1、組織固定越新鮮越好，盡快固定，多選用4%多聚甲醛固定液。但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液；

2、組織脫水和透明時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整；

3、切片展片時有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當?shù)卦谒屑尤霂椎我掖迹?/span>

4、烤片：要控制烤片的溫度和時間，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。烤片的時候

5、切片呈60°角斜立，切片和載玻片之間的水滴或氣泡會從邊緣滑出，減少對切片的損壞；

蠟塊及切片的保存：最好在4℃保存；

6、脫片問題：Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡3min，晾干，即可進行下一步；

7、滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活；

8、暴露抗原：對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等；

9、封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉；

抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用；

10、背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗；

11、顯色：DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；

12、返藍：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍；

整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。