條件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重組系統(tǒng)

條件性基因 敲除主要是通過Cre／10xP或者Ftp／FRT重組系統(tǒng)來實現(xiàn)的。這兩個系統(tǒng)都是位點特異性重組酶系統(tǒng)，已發(fā)展成為在體內(nèi)、外進行遺傳操作的有力工具。這兩個系統(tǒng)的應(yīng)用，可以使靶基因的表達或缺失發(fā)生在試驗動物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官。此外，若與控制Cre或Flp表達的其他誘導(dǎo)系統(tǒng)相結(jié)合，還可以對某一基因同時實現(xiàn)時空兩方面的調(diào)控。

1．Cre／loxP系統(tǒng)的原理

Cre／loxP系統(tǒng)來源于F1噬菌體，可以介導(dǎo)位點特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩種成分：①一段長34bp的DNA序列，含有兩個13 bp的反向重復(fù)序列和一個8 bp的核心序列。這段34bp序列是重組酶識別的位點，被稱為loxP位點(10cus of X―over in P1)。②Cre重組酶(cyclizationrecombination)，它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)loxP位點的DNA重組。任何序列的DNA，當(dāng)其位于兩個loxP位點之間的時候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個loxP位點的方向相同)，要么方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)(兩loxP位點的方向相反)，如圖所示。

Cre／loxP系統(tǒng)的作用機制

2．Cre／loxP系統(tǒng)優(yōu)點

Cre／10xP系統(tǒng)之所以在基因敲除中獲得了非常廣泛的應(yīng)用，是由該系統(tǒng)的諸多優(yōu)點決定的：①Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點的DNA片斷形成復(fù)合物后，可以提供足夠的能量引發(fā)之后的DNA重組過程，因此該系統(tǒng)不需要細胞或者生物體提供其他的輔助因子；②loxP位點是一段較短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，因此可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發(fā)揮作用；④Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動子的調(diào)控之下，從而使這種重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官，以及不同的發(fā)育階段或不同的生理條件下產(chǎn)生，進而發(fā)揮作用，這一點也是該系統(tǒng)在應(yīng)用過程中最為重要的一點。

3．Cre／loxP系統(tǒng)的工作流程

利用Cre／loxP系統(tǒng)實現(xiàn)體內(nèi)某特定基因在特定條件下的敲除，需要兩只轉(zhuǎn)基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干細胞技術(shù)獲得，首先在體外構(gòu)建一個在目的基因兩端分別含有一個loxP位點的基因序列，之后將體外構(gòu)建好的這段基因序列轉(zhuǎn)入胚胎干細胞內(nèi)，使其通過同源重組替代細胞基因組內(nèi)原來的基因序列。經(jīng)過這樣處理的胚胎干細胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育成為一個完整的胚胎，最終成為一只轉(zhuǎn)基因小鼠。在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中，loxP位點被引入到相應(yīng)基因的內(nèi)含子內(nèi)，理論上不會對相應(yīng)基因的功能產(chǎn)生影響，因此一般情況下，該小鼠的表型是正常的。第二只轉(zhuǎn)基因小鼠一般采用卵母細胞注射或者胚胎干細胞技術(shù)獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于某特定基因啟動子的調(diào)控之下，可以使其在某特定的條件下表達。最后，讓這兩只小鼠進行交配，產(chǎn)生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的細胞中缺失某一特定的基因。

很明顯，在何種組織細胞或器官中敲除某一特定的基因取決于所選擇的啟動子。只要選擇合適的啟動子調(diào)控Cre重組酶的表達，使其在生物體特定的部位、特定的條件下產(chǎn)生，就可以實現(xiàn)相應(yīng)條件下某一特定基因的敲除。迄今為止，研究者們已經(jīng)成功地利用多個不同的啟動子實現(xiàn)了在不同條件下的基因敲除，這些啟動子可以是細胞類型特異的，如lck啟動子(胸腺細胞)、alphaA晶狀體球蛋白啟動子(眼晶狀體)、鈣調(diào)素依賴性激酶Ⅱ啟動子(海馬和大腦新皮質(zhì))、乳清酸性蛋白啟動子(乳腺)、aP2啟動子(脂肪組織)、AQP2啟動子(腎臟集合管)和肌漿蛋白啟動子(骨骼肌)等。啟動子也可以受某些外源性化學(xué)物質(zhì)的調(diào)控，外源性調(diào)控的基因敲除可以避免在胚胎發(fā)育早期由于基因功能的異常所產(chǎn)生的副作用，如干擾素反應(yīng)Mxl啟動子、他莫西酚依賴的雌激素突變體啟動子和四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)等