細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)大概是最簡單的分析細(xì)胞遷移能力的試驗(yàn)了，但是，你以為劃痕實(shí)驗(yàn)就是簡單的給細(xì)胞”劃“一個”痕跡“?并不是的，在實(shí)驗(yàn)操作中，你可能會狀況百出，比如細(xì)胞鋪板數(shù)量過多或過少啦、劃痕不均一啦，細(xì)胞不遷移啦等等，所以今天，我們就一起看看如何把細(xì)胞遷移入門之劃痕實(shí)驗(yàn)做得更好更漂亮!

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)入門之——劃痕實(shí)驗(yàn)

首先，我們必須得了解一下細(xì)胞遷移的重要性：

細(xì)胞遷移(cell migration)：也稱為細(xì)胞移動、細(xì)胞爬行或細(xì)胞運(yùn)動，是指細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。

它參與到很多生理和病理的活動中，如下：

免疫：如淋巴細(xì)胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關(guān)鍵之一;

炎癥：炎癥反應(yīng)最重要的功能是將白細(xì)胞送到炎癥灶，白細(xì)胞遷移到炎癥部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用;

腫瘤轉(zhuǎn)移：腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化后最常見的活動，如侵入淋巴管、血管后隨脈管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;

損傷修復(fù)：當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)，免疫細(xì)胞和血小板會遷移到損傷部位，參與消炎和凝血;

胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細(xì)胞遷移至特異靶位以保證各組織、器官的正常發(fā)育。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的基本原理：

在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，邊緣的細(xì)胞會逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合。因其類似體外傷口愈合過程，又名傷口愈合實(shí)驗(yàn)(Wound-Healing Assay)，廣泛用于可以觀察藥物、基因等外源因素對細(xì)胞遷移和修復(fù)的影響。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)過程：

在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間(可有不同時(shí)間點(diǎn))，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察周邊細(xì)胞是否遷至中央劃痕區(qū)，并拍照。

具體實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 培養(yǎng)板劃線標(biāo)記

用marker筆在6孔板背后畫橫線(用直尺比著)，每孔至少穿過5條線，每條線均勻且平行。

2. 細(xì)胞鋪板

在孔內(nèi)接種約5-10*105個細(xì)胞(可根據(jù)細(xì)胞的生長快慢調(diào)整接種數(shù)量)，原則為過夜后細(xì)胞能夠長滿，切記一定要鋪勻(細(xì)胞鋪板均勻技巧可參考往期內(nèi)容)。

3. 細(xì)胞劃線

第二天用20uL槍頭(滅菌)或牙簽，垂直孔板背后的黑線劃痕，使劃痕與標(biāo)記線相交。

Tips：

減少劃痕距離的誤差辦法——

●不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽;

●槍頭要垂直，不能傾斜，劃痕時(shí)可比著直尺;

●最好保持力度一致，盡量一次性劃完。

4. 洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞

劃線完成后，使用無菌PBS洗細(xì)胞2-3次，去除劃下的細(xì)胞，使留下的間隙肉眼即清晰可見，然后更換新鮮無血清或低血清(<2%)的培養(yǎng)基。

Tips：

●在用PBS緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞;

●為了避免細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響，盡量不要用吸泵，可用移液槍緩慢吸走。

5. 細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

將細(xì)胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，如0，6，12，24小時(shí)后取出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察并拍照。

6. 數(shù)據(jù)分析

使用 Image J 軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取 6 至8 條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。

注意事項(xiàng)

1，劃痕實(shí)驗(yàn)一般選擇6孔板?因?yàn)?孔板大小適中，可保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，便于觀察;當(dāng)然若是需要高通量初篩時(shí)，也可以用12或者24孔板。

2，細(xì)胞的接種密度原則一般是過夜為100%融合，若過夜后細(xì)胞未100%融合，雖可以適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間，但因細(xì)胞密度已經(jīng)很大，所以細(xì)胞狀態(tài)會逐漸變差，后續(xù)細(xì)胞可能不遷移而是凋亡。

3，降低細(xì)胞增殖對遷移造成的假陽性結(jié)果的方法：

① 使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響; ② 一般認(rèn)為24h為細(xì)胞的一個周期，在選取合適的時(shí)間點(diǎn)(6，12，24h)檢測劃痕寬度時(shí)，最好不要超過細(xì)胞一個周期的時(shí)間;③ 如果要單純考慮細(xì)胞遷移，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理1h，抑制細(xì)胞的分裂。

4，確保拍照的觀察點(diǎn)固定：按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，劃痕一次與5條定位線相交，就有10個可固定監(jiān)測點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問題。