在基礎(chǔ)實驗中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)是我們很常運用的一個原理，像免疫組化、免疫熒光、免疫印跡試驗（Western Blot）、ELISA等都是常見又很重要的幾種實驗。而實驗的關(guān)鍵步驟，就在于抗體的選擇。抗體選擇不好，實驗結(jié)果可能不盡如人意。

所以，抗體的挑選這一步驟至關(guān)重要，本篇文章，就和大家聊聊如何挑選抗體和一些小Tips

一、明確實驗的目的

首先明確自己實驗的目的是什么，根據(jù)自己的實驗?zāi)康倪x擇相應(yīng)的實驗方法和抗體，對于實驗的來講，往往會起到事半功倍的效果。一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過適用于何種分析類型，如：可以應(yīng)用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗驗證。為了避免實驗風(fēng)險，當(dāng)說明書中沒有提及的應(yīng)用方法時，可向商家申請測試裝，進行測試后，再決定是否購買。

01:WB

WB的蛋白經(jīng)過加熱變性之后都變成線性的結(jié)構(gòu)。因此好的抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來做實驗，結(jié)果也非常特異。

02:IP/CHIP

我們用抗體去結(jié)合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP的抗體使用純化的天然蛋白制作的抗體來做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。不要用人工合成多肽制作的抗體，因為這種抗體識別的位點可能被深深地藏在了蛋白的內(nèi)心深處。CHIP和IP沒有太大的區(qū)別，問題在于，如果抗體識別的表位和該蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合的部位一致，則會導(dǎo)致CHIP實驗的失敗。

03:IF/IHC

免疫熒光和免疫組化中需要進行固定一步，固定是為了盡量讓細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區(qū)別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結(jié)構(gòu)。因此在做IF/IHC實驗中，合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質(zhì)的表面）。

04:FC

流式細胞中分為兩種，一種是活細胞的流式，這種流失采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來做，另外一種是經(jīng)過固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。在做流式細胞中，我們有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記，間接標(biāo)記不如直接標(biāo)記真實準(zhǔn)確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標(biāo)記的抗體；如果研究的蛋白沒有直接標(biāo)記的抗體，那么就采用間接標(biāo)記抗體，需要添加熒光二抗。

二、確定實驗樣本種屬

一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過適用于何種動物或人的標(biāo)本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等動物的標(biāo)本的實驗。也就是說應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高。

如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過。為了避免實驗風(fēng)險，盡量不要使用說明書中沒有提及的標(biāo)本的種屬的抗體?；蛘咄ㄟ^序列比對的方法來預(yù)測交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy和NCBI BLAST來進行不同物種蛋白同源性比對。如果比對結(jié)果，證明同源性比較高的，也可以選擇。將抗體的免疫原序列與想檢測的物種的蛋白序列進行比對，如果重合比對結(jié)果重復(fù)度大于85%，那么兩者可能會發(fā)生交叉反應(yīng)效應(yīng)（即使是比對得分大于85%，也無法完全保證抗體一定會識別）需要使用多個對照來確定該抗體是否與靶標(biāo)特異地結(jié)合。

三、分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇合適的抗體，至少需要考慮兩方面因素：

1、待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機體（如：細菌）或細胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS 流式檢測活細胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。

2、樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時，應(yīng)注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會在抗體說明書上應(yīng)用部分標(biāo)示出來。

四、抗體宿主的選擇

一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，**好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細胞裂解物樣本的western blotting檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。