在我們?nèi)粘５目蒲兄校?xì)胞實(shí)驗(yàn)是每個(gè)課題必不可少的一部分。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有重要的意義，可以通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)評(píng)估藥物的有效性、毒性、耐藥性、藥物對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖等作用的影響。下面我們來一起學(xué)習(xí)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)的知識(shí)把！

細(xì)胞的復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇的概述

細(xì)胞復(fù)蘇的原則——快速融化：須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）將水浴鍋預(yù)熱至37℃。

（2）用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。

（3）在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

2、取出凍存管

（1）根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。

（2）從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。

3、迅速解凍

（1）迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的凍存細(xì)胞外的冰晶迅速融化。

（2）約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。

4、平衡離心

   用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min。

5、制備細(xì)胞懸液

（1）吸棄上清液。

（2）向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。

6、細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。

7、培養(yǎng)細(xì)胞

將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

注意事項(xiàng)

1、選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑及復(fù)合物配比濃度；

2、純化 siRNA；

3、避免 RNA 酶污染；

4、健康的細(xì)胞培養(yǎng)物；

5、避免使用抗生素；

6、避免培養(yǎng)細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基。

細(xì)胞的傳代

實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)，同時(shí)也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就須進(jìn)行傳代。

傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。

實(shí)驗(yàn)材料

1、細(xì)胞：貼壁細(xì)胞株；

2、試劑：0.25%胰酶、1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清）；

3、儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、將長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。

2、加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細(xì)胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，原貼壁的細(xì)胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10ml培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當(dāng)見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為1—3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實(shí)踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。

注意事項(xiàng)

消化液配制方法：

稱取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，濾器過濾除菌，4℃保存，用前可在37℃下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使終濃度達(dá)0.02%。

細(xì)胞凍存

實(shí)驗(yàn)原理

在－70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

實(shí)驗(yàn)材料

生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)細(xì)胞，新鮮培養(yǎng)基，DMSO，無菌塑料冷凍保存管，血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形,細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2、配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。

3、依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞與凍存管內(nèi)，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度。

4、先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

5、接著置于-20℃冰箱，約30-60min。

6、置于-80超低溫冰箱中放置過夜。

7、置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。

8、同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

細(xì)胞培養(yǎng)中的無菌操作技術(shù)

注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作臺(tái)面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無菌操作臺(tái)面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株的操作。

2、無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在臺(tái)面的中央無菌區(qū)域，勿在邊緣的非無菌區(qū)域操作。

3、小心取用無菌的實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4、工作人員應(yīng)注意自身的安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心毒性藥品，并避免尖銳針頭的傷害等。

5、定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：

（1）CO2 鋼瓶的CO2壓力。

（2）CO2 培養(yǎng)箱的CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。

（3）無菌操作臺(tái)內(nèi)的airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。

6、水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)概述

細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在鈣離子和鎂離子依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。

實(shí)驗(yàn)原理

過氧化物酶標(biāo)記測(cè)定法。

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正在凋亡的細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)材料

試劑配制：

1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。

4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調(diào)節(jié)pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

5、TdT酶反應(yīng)液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。

6、洗滌與終止反應(yīng)緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml。

7、0.05％二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。

8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。

9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（ONCOR）。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、標(biāo)本預(yù)處理：

（1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（3）培養(yǎng)的或從組織分離的細(xì)胞的預(yù)處理：將約 5 × 107個(gè)/ml細(xì)胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細(xì)胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應(yīng)5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37C反應(yīng) 1hr（注意：陰性染色對(duì)照，加不含TdT酶的反應(yīng)液）。

5、將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動(dòng)。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，后1次5min。

10、于室溫用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

注意事項(xiàng)

要設(shè)立陽性和陰性細(xì)胞對(duì)照。陽性對(duì)照的切片可使用DNaseI部分降解的標(biāo)本，陽性細(xì)胞對(duì)照可使用地塞米松處理的大、小鼠胸腺細(xì)胞或人外周血淋巴細(xì)胞。陰性對(duì)照不加TdT酶。

MTT實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)原理

MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000－10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。

2、培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3－5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。

3、呈色：培養(yǎng)3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml） 20ul。繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。

4、比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

注意事項(xiàng)

1、選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。

2、避免血清干擾。

3、設(shè)空白對(duì)照。

4、MTT實(shí)驗(yàn)吸光度要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

1、檢測(cè)細(xì)胞表面以及胞內(nèi)的各種標(biāo)志，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分群鑒定以及比較各種蛋白表達(dá)量高低。

2、檢測(cè)細(xì)胞的增殖以及凋亡。

3、流式細(xì)胞術(shù)可用來分析細(xì)胞周期。