原理

流式細(xì)胞儀通常根據(jù)細(xì)胞膜完整性將細(xì)胞分為“活細(xì)胞“和“死細(xì)胞”，因此正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞歸為活細(xì)胞?；罴?xì)胞染料如Hoechst 33342能許進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞沒(méi)有太大得細(xì)胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度增高的機(jī)制與凋亡細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變有關(guān)，凋亡細(xì)胞早期細(xì)胞膜的完整性沒(méi)有明顯性改變，但細(xì)胞膜的通透性已有增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342比正常細(xì)胞的多。

此外，還與凋亡細(xì)胞的染色體DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合以及凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等有關(guān)。既然Hoechst 33342進(jìn)入凋亡細(xì)胞中比正常細(xì)胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不經(jīng)固定的情況下對(duì)這些染料是拒染，壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。

根據(jù)這些特性，用Hoechst 33342結(jié)合PI或EB等染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為: 正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色 (Hoechst33342+/PI+)，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色(Hoechst 33342++/PI+) ，壞死細(xì)胞為低藍(lán)色高紅色 (Hoechst 33342+/PI++)。

材料與儀器

細(xì)胞  Heochst 33342  染液  PBS  蒸留水  400目篩網(wǎng)  流式細(xì)胞儀  冰箱

步驟

一、細(xì)胞培養(yǎng)

懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst33342，終濃度為1 ug/ml; 37°C孵育7-10min。

二、細(xì)胞收集

低溫500 ~ 1000 r/min離心5min棄去染液。

三、染色

加入1.0 ml PI染液，4C避光染色15 min。

四、過(guò)濾

400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次。

五、流式細(xì)胞儀分析

Heochst 33342用氟激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為352 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)為400~ 500nm，產(chǎn)生蘭色熒光;PI用離子激光激發(fā)熒光激發(fā)光波波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。

六、結(jié)果判斷

在蘭色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為: 正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。

注意事項(xiàng)

1.在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細(xì)胞周亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。

2.用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20 min之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。

常見問(wèn)題

1.在紅色熒光對(duì)蘭色熒光散點(diǎn)圖上，還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。

2.用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20 min之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影影響結(jié)果的判斷。