原理

主要根據(jù)細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變，包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態(tài)的改變等進行檢測。

材料與儀器

細胞  PBS   PI  蒸餾水  乙醇  棕色瓶  400目篩網(wǎng)   流式細胞儀

步驟

一、收集細胞

收集細胞{數(shù)目約 (1~ 5) x106個/mL] ，500~1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。

二、細胞洗滌

3 ml PBS洗滌1次。

三、乙醇固定

離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定4°C，1-2小時。

四、細胞重懸

離心棄去固定液，3 mIPBS重懸5 min。

五、細胞過濾

400目的篩網(wǎng)過濾1次，500-1000 r/min離心5min，棄去PBS。

六、染色

用1 ml PI染液染色，4C避光30 min。

七、流式細胞儀檢測

PI用氟離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488 nm,發(fā)射光波波長大于630 nm，產生紅色熒光分析P熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。

八、結果判斷

在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降低，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關;在分析PI熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片，在Pl熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/GO期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/GO期所在位置的熒光強度為1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45，可用雞和鮮魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

注意事項

細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致。在分析結里時應該注意。

常見問題

1.由于凋亡細胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細胞進行染色，其DNA可染性降低。許多學者把這種DNA可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一。

2.凋亡細胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上，前散射光與細胞的大小有關，而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用，與細胞內的顆粒多少有關。在細胞凋亡時，細胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降解，核破裂形成，細胞內顆粒往往增多，故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死時，由于細胞腫脹，其前散射光增大;側散射光在細胞壞死時也增大，因此可根據(jù)前散射光和側散射光區(qū)別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是，根據(jù)前散射光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優(yōu)點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋E亞型。也可用于活細胞的分類。