動(dòng)物的選擇

目前，肺纖維化動(dòng)物模型有采用體型較小鼠類（如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等）和兔。其中 C57BL/6 小鼠、BALA/C 小鼠、KM 小鼠和 ICR 小鼠，Wistar 大鼠和SD 大鼠是用于肺纖維化模型最常用的種類，也有選用體型較大的犬、豬、羊和靈長(zhǎng)類動(dòng)物等，模型選用的動(dòng)物種類因研究目的和造模方法不同而異。

鼠類是較多選用的肺纖維化動(dòng)物模型，體型小、體重輕、價(jià)格便宜，有氣管灌注、霧化吸入、經(jīng)鼻給藥、腹腔注射、靜脈注射等多種給藥方式，是常用的造模動(dòng)物，但因其體型太小不適用于放射影像學(xué)的研究，需要通過(guò)解剖摘取肺部進(jìn)行組織病理學(xué)檢查的方法判斷造模是否成功。

豬、猴等大型動(dòng)物體型大，心臟及肺部組織結(jié)構(gòu)與人相似，并且可通過(guò)影像學(xué)方法在無(wú)創(chuàng)條件下動(dòng)態(tài)觀察動(dòng)物造模情況，但價(jià)格昂貴，操作較復(fù)雜。

造模方法

目前已建立多種誘發(fā)動(dòng)物肺纖維化模型的方法，包括基因相關(guān)模型與非基因相關(guān)模型?；蛳嚓P(guān)模型是指通過(guò)基因工程使動(dòng)物成為肺纖維化模型，而非基因相關(guān)模型是指在相同或相似的遺傳背景下，通過(guò)環(huán)境因素、藥物毒物或其他因素誘導(dǎo)得到的肺纖維化模型。

一、基因相關(guān)方法致肺纖維化模型

轉(zhuǎn)基因方法包括細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)法、靶向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷法。

1.SD大鼠細(xì)胞因子過(guò)表達(dá)法致肺纖維化模型步驟

前期準(zhǔn)備：AdTGF-β1223/225 及腺病毒空載體 -70℃保存，臨用前經(jīng)病毒稀釋液稀釋成 1×109pfu（病毒稀釋液由三種溶液構(gòu)成，其配制方法：A 液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.15 g，KH2PO4 0.2 g，加雙蒸水定容至100 mL，高壓消毒；B 液：CaCl2·2H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒；C 液：MgCl2·6H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒。用前取 98 mL A 液、1 mL B 液、1 mL C 液混合備用。

操作步驟：選用 SD 大鼠，體質(zhì)量（250±15） g，腹腔注射速眠新麻醉（0.4 mL·kg-1），無(wú)菌操作，剪開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露氣管，經(jīng)喉頭下一次性注入 0.4 mL AdTGF-β1223/225 腺病毒液，手術(shù) 6 h 后觀察并記錄動(dòng)物生理反應(yīng)。

模型驗(yàn)證：分別與造模后 d 7、d 14、d 21，麻醉后開(kāi)胸，左心室插管，先灌流溫?zé)幔ㄊ覝兀┥睇}水，剪開(kāi)右心耳放血，待流出液變澄清后再緩慢灌流 4% 多聚甲醛水溶液（200 mL·30 min-1）。小心摘取整個(gè)肺和心，經(jīng)氣管恒壓（2 452 Pa）灌注 4% 多聚甲醛固定液 10 min，使肺泡恢復(fù)擴(kuò)張狀態(tài)。沿縱軸切取肺組織浸入 4% 多聚甲醛固定液中固定 24 h，做常規(guī)石蠟包埋、石蠟切片、HE 染色和 Mallory 染色，光鏡觀察、攝片。

2.靶向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷法

靶向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將白喉毒素受體與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞啟動(dòng)子通過(guò)載體融合，白喉毒素不斷刺激轉(zhuǎn)基因小鼠，致肺纖維化。通過(guò)敲除特定基因或?qū)胪蛔兓蚴够蛲蛔円材芙⒎卫w維化動(dòng)物模型，與肺纖維化有關(guān)的基因包括：肺表面活性蛋白C、肺表面活性蛋白A2（SFTPA2）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和端粒酶 RNA復(fù)合酶（TERC）。

轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)勢(shì)：基因技術(shù)造模方法比較于傳統(tǒng)造模方法，靶點(diǎn)明確，對(duì)篩選抗纖維化藥物意義重大。除此之外，通過(guò)誘導(dǎo)時(shí)間特定啟動(dòng)子，可模擬肺纖維化晚期出現(xiàn)的臨床癥狀。

轉(zhuǎn)基因方法的劣勢(shì)：介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因用的病毒載體本身具有潛在危害性，且人類肺纖維化是多基因多種因子作用的結(jié)果，因此單一的基因模型與多基因相關(guān)的肺纖維化模型存在一定差異。

二、非基因相關(guān)方法致肺纖維化模型

常用的非轉(zhuǎn)基因方法主要為物理化學(xué)方法，包括博萊霉素誘導(dǎo)法、平陽(yáng)霉素誘導(dǎo)法、百草枯誘導(dǎo)法、石棉誘導(dǎo)法、輻射誘導(dǎo)法?；瘜W(xué)誘導(dǎo)法及石棉誘導(dǎo)法通常通過(guò)皮下、靜脈注射，或者霧化吸入等途徑給藥，輻射誘導(dǎo)法則直接進(jìn)行射線照射。

一、博萊霉素致肺纖維化模型

目前博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化有氣管內(nèi)一次給藥或多次給藥，也有腹腔給藥、鼻內(nèi)給藥、靜脈給藥、霧化吸入多種方式。氣管內(nèi)一次給藥是最常用的造模方式。

1.1 大鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素致肺纖維化模型

步驟：選用健康雄性8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，用 10% 水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，開(kāi)口器固定口腔，拉出舌，用壓舌板壓舌腹，在額鏡直視下，趁動(dòng)物吸氣瞬間迅速行氣管插管（Ф 2 mm，4~5 cm），緩慢注入 5 mg·kg-1BLM 0.2~0.3 mL，立即旋轉(zhuǎn)動(dòng)物，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標(biāo)本。

特點(diǎn)：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但動(dòng)物死亡率較高，操作復(fù)雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周?chē)鸀轱@著的特點(diǎn)。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物肺纖維化是國(guó)內(nèi)外最常用、最受認(rèn)可的肺纖維化模型。

1.2 倉(cāng)鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素致肺纖維化模型

步驟：取10 周齡雄性敘利亞倉(cāng)鼠，用生理鹽水配制 1 U 博萊霉素溶液，單次氣管內(nèi)注射 0.1 mL，注射藥物 3 周后，取肺組織進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)，3H-TdR 整合實(shí)驗(yàn)評(píng)估成纖維細(xì)胞增殖效果。

特點(diǎn)：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但動(dòng)物死亡率較高，操作復(fù)雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周?chē)鸀轱@著的特點(diǎn)。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉素誘導(dǎo)的動(dòng)物肺纖維化是國(guó)內(nèi)外最常用、最受認(rèn)可的肺纖維化模型。

1.3 大鼠腹腔內(nèi)注射博萊霉素致肺纖維化模型

步驟：選用健康雄性 8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，每日腹腔注射 15 mg·kg-1 BLM 10 天，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標(biāo)本。

特點(diǎn)：腹腔內(nèi)給藥法具有給藥次數(shù)多、劑量大、制模時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，但動(dòng)物死亡率相對(duì)較低，且操作簡(jiǎn)便，急性肺損傷程度較輕、膠原代謝紊亂的程度較重，病灶分布均勻，以胸膜下為顯著的特點(diǎn)。

1.4 小鼠鼻腔滴入博萊霉素致肺纖維化模型

步驟：選用 SPF 級(jí)雌性 ICR 小鼠，6~8 周齡，體質(zhì)量16~18 g，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，鼻腔滴注博萊霉素造模。用乙醚麻醉小鼠，后用微量移液器吸取 50 μL 博萊霉素溶液（15 mg·kg-1 進(jìn)行干預(yù)），經(jīng)鼻腔緩慢滴入小鼠氣管內(nèi)，放入鼠籠內(nèi)安置，觀察其造模后一般情況。

二、平陽(yáng)霉素致肺纖維化模型

平陽(yáng)霉素是一種抗腫瘤抗生素，具有肺毒性，文獻(xiàn)中通常采用大小鼠氣管注射或霧化吸入的方式建立肺纖維化模型。

2.1 大鼠氣管穿刺注入平陽(yáng)霉素致肺纖維化模型

步驟：選用SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，將平陽(yáng)霉素用生理鹽水配成 5 g·L-1 的溶液。10% 水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）麻醉大鼠，頸部皮膚消毒，剪去頸部鼠毛，行頸正中切口，分離暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺，注入平陽(yáng)霉素 5 mg·kg-1，立即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，縫合皮膚，自由飲水、攝食，保持自然光照，d 28 采集標(biāo)本。

2.2 大鼠霧化吸入平陽(yáng)霉素致肺纖維化模型

步驟：將 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，放入長(zhǎng)、寬、高各 40 cm 玻璃缸內(nèi)，玻璃缸與超聲霧化器相連通，通過(guò)霧化管向缸內(nèi)噴入霧化液，缸上蓋薄塑料板，板上留一個(gè)小的通氣孔。將平陽(yáng)霉素和生理鹽水配成2 mg·mL-1的溶液，霧化吸入10 min。自由飲水?dāng)z食，d 28 采集標(biāo)本。

三、百草枯致肺纖維化模型

3.1 小鼠口服百草枯致肺纖維化模型

步驟：有研究表明，昆明小鼠口服百草枯的 LD50 為 137.3 mg·kg-1，給予百草枯后小鼠全部存活的劑量為 100 mg·kg-1，故確定百草枯的給藥劑量為 100 mg·kg-1。KM 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，禁食 16 h 后，一次性灌胃 20% 百草枯水溶液后正常進(jìn)食、飲水。

四、石棉微粒致肺纖維化模型

石棉纖維經(jīng)氣管內(nèi)單次灌注給藥（<5 μm 直徑的石棉顆粒）是一種相對(duì)快速的纖維化造模方式，操作簡(jiǎn)便、快速、成功率高。

4.1 大鼠肺注入石棉微粒致肺纖維化模型

步驟：取石棉成品，經(jīng)研磨，用 200 目鋼篩濾過(guò)、水選，制備石棉微粒。95% 以上石棉粉塵微粒直徑 <5 μm，用生理鹽水配成 20 mg·mL-1 的濃度，經(jīng)高壓滅菌備用。選用Wistar大鼠，雌性，體質(zhì)量（180~200）g，將 Wistar 大鼠置密封罐中，滴入乙醚，待充分麻醉后，將 20 mg·mL-1 的石棉生理鹽水 1 mL，人耳鏡插入大鼠氣管開(kāi)口，確認(rèn)聲帶活動(dòng)后，用腰分針（折去頭），直接注入肺內(nèi)，輕揉雙肺片刻。在 2、4、6、8 周分別處死后，立即取大鼠肺、心、肝、腎等組織浸泡在福爾馬林內(nèi)。

五、輻射誘導(dǎo)法致肺纖維化模型

5.1 大鼠輻射誘導(dǎo)法致肺纖維化模型

步驟：選用雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，無(wú)異常者進(jìn)行 60 Coγ射線全胸單次照射，照射野為4.5 cm×4.0 cm，照距為3 m，劑量率為2.7 Gy·min-1，劑量為30 Gy。照射時(shí)，將大鼠上至兩腋窩、下至胸骨劍狀突的位置對(duì)準(zhǔn)此照射野，用 10 cm 厚鉛磚屏散裝置屏蔽大鼠其余部分，照射后隨機(jī)分籠喂養(yǎng)。分別于照后 3、7、14、21、28、42、56、70、90、180、270、365d 共 12 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材觀察。取各時(shí)間點(diǎn)肺臟經(jīng)病理宏觀檢查后，固定于 12%緩沖中性福爾馬林中，用常規(guī)法制成石蠟切片，經(jīng) HE染色后進(jìn)行光鏡觀察。

總結(jié)

動(dòng)物模型是研究肺纖維化的重要工具，目前還沒(méi)有一種肺纖維化模型能完全模擬臨床肺纖維化病理特點(diǎn)，但利用現(xiàn)有的肺纖維化模型，我們能通過(guò)不同類型的肺纖維化模型了解肺纖維化不同特點(diǎn)，篩選更敏感的模型。隨著技術(shù)進(jìn)步和研究的改進(jìn)，我們也會(huì)建立更符合臨床肺纖維化病理特征的動(dòng)物模型。