實(shí)驗(yàn)技巧
TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡原則及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵步驟：
1. 充分脫蠟和水化。脫蠟前可先將切片在 60oC烤片 20 min，再使用二甲苯脫蠟2次，每次 5-10 min;而水化一般建議用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，便于后期試劑能充分、均勻的結(jié)合反應(yīng)。
2. 把握好細(xì)胞通透的時(shí)間。一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間，常用 10-30 min，幾 μm 厚的切片用短時(shí)間;幾十 μm厚的 切片用長(zhǎng)時(shí)間，通過(guò)摸索達(dá)條件使實(shí)驗(yàn)過(guò)程做到既不脫片，也能夠使后面的酶或抗體進(jìn)入胞內(nèi)。
3. 適當(dāng)延長(zhǎng) TUNEL 反應(yīng)液的時(shí)間。一般是37oC孵育 1 h，也可以根據(jù)細(xì)胞的凋亡損傷程度，選擇更長(zhǎng)的時(shí)間，可長(zhǎng)至 2 h，但要結(jié)合實(shí)驗(yàn)最終的背景著色來(lái)確定。
4. DAB 顯色條件的選擇。如果是用DAB顯色，一般 DAB 反應(yīng)不超過(guò)10 min，可結(jié)合顯微鏡觀(guān)察控制背景顏色，有可能幾十秒種就能顯色。
5. PBS 的充分清洗。在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗請(qǐng)嚴(yán)格遵守清洗條件，次數(shù)可增加到 5 次，以降低切片的非特異性著色。
6. 內(nèi)源性 POD 的封閉。對(duì)于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，可適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間和升高過(guò)氧化氫的濃度，可以達(dá)到較好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。
細(xì)胞通透的時(shí)間選擇：
1. 蛋白酶 k 的目的是通透細(xì)胞膜和核膜，從而使反應(yīng)試劑能充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高陽(yáng)性率。但濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易造成脫片，其作用類(lèi)似與 TritonX100 等細(xì)胞通透劑。
2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,亦可自行將濃縮液配制1-10 mg/ml。蛋白酶K可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液(100 mM Tris HCl pH8.0, 50 mM EDTA)，分裝后-20oC保存。
3. 蛋白酶K反應(yīng)時(shí)間一般為10-30 min，具體時(shí)間長(zhǎng)短與切片厚薄有關(guān)，4 μm左右的片子可以通透 10 min，如切片厚度30 μm左右的可延長(zhǎng)至30 min，需實(shí)驗(yàn)摸索最佳時(shí)間。通透時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易脫片、過(guò)短起不到通透效果。
關(guān)鍵試劑操作條件：
1. DAB 顯色反應(yīng)大約需要30s-5 min，要控制好反應(yīng)時(shí)間，勿使背景顏色過(guò)深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來(lái)源和切片厚度、試劑盒說(shuō)明摸索條件。
2. 蛋白酶K工作液處理時(shí)間、溫度須在范圍內(nèi)摸索，溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易造成脫片且可能破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。
3. 陽(yáng)性樣本的DNase 1處理一般建議室溫，10 min 即可。
如何減弱非特異性染色：
肝臟或腎臟，因富含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，需要增加過(guò)氧化氫濃度和延長(zhǎng)孵育時(shí)間。其他還可以加強(qiáng)滅活、縮短 DAB 孵育時(shí)間、PBS 充分清洗，顯微鏡下把握好著色情況。
常見(jiàn)問(wèn)題分析：
現(xiàn)象 | 可能原因 | 建議 |
非特異性染色 | TdT酶的濃度過(guò)高 | 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀釋 |
TdT酶反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或TdT酶反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)。 | 注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TdT酶反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。 | |
光照紫外線(xiàn)導(dǎo)致包埋試劑的聚合（如：甲基丙烯酸會(huì)導(dǎo)致樣本DNA的斷裂） | 嘗試改用其它包埋材料或其它聚合試劑 | |
在固定組織時(shí)樣本DNA已斷裂（內(nèi)源核酸酶的作用） | 確保樣品取樣后立即固定或通過(guò)肝靜脈灌注固定 | |
使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海缫恍┧嵝怨潭ㄒ?br/> | 采用推薦的固定液 | |
固定后某些核酸酶活性依然較高導(dǎo)致DNA斷裂 | 用含有dUTP和 dAPT的溶液封閉 | |
標(biāo)記率低 | 如果以乙醇或甲醇固定的樣本則標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失） | 用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定 或福爾馬林或戊二醛固定。 |
固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高 | 減少固定時(shí)間，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定 | |
熒光淬滅 | Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅，需注意避光操作 | |
促滲條件不佳，以致于試劑不能到達(dá)靶分子或濃度過(guò)低 | 1、增加通透劑促滲時(shí)間 2、增加通透劑的作用溫度（15-25℃） 3、優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時(shí)間（如：以400ug/ml作用5min） 4、0.1M的檸檬酸鈉70℃作用30min。 | |
熒光背景很高 | 支原體污染 | 請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否為支原體污染 |
TdT酶的濃度過(guò)高或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 用TdT dilution buffer* 作1︰2—1︰10稀釋或注意控制反應(yīng)時(shí)間 | |
紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。 高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。 | 宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。 | |
陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有信號(hào) | DNase I工作液的濃度過(guò)低。 | 增加DNase I工作液濃度 |
組織樣本從載玻片脫落 | 組織樣本被酶從玻片消化下來(lái) | 降低蛋白酶K的處理時(shí)間 |