一、細胞凋亡的機理

1. 線粒體途徑:

線粒體是細胞發(fā)生凋亡的主要調(diào)控場所并參與了大多數(shù)細胞凋亡的調(diào)控過程。此通路由含 BH3結構域的 Bc-l2家族成員 Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa 等在接受到胞內(nèi)的死亡信號后激活。這些含 BH3結構域的 Bc-l2家族成員與Bax 亞家族成員Bax、Bak 等作用，導致后者的寡聚并插入線粒體膜引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失?釋放細胞色素 C和其他蛋白。細胞色素 C的釋放是線粒體凋亡路徑的主要步驟，在 ATP/dATP 存在的情況下細胞色素 C與凋亡蛋白酶活化因子Apaf1形成多聚復合體，通過Apaf-1氨基端的 Caspase 募集結構域（CARD）募集胞質(zhì)中的 Caspase-9前體，并使其自我剪切活化并啟動Caspase 級聯(lián)反應，激活下游的 Caspase-3和 Caspase7，完成其相應底物的剪切，引起細胞凋亡。

2. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路不同于線粒體或死亡受體介導的凋亡通路。Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子平衡的破壞或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的過量積累都會誘導Caspase-12表達，同時也導致胞質(zhì)的Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。Caspase-7激活Caspase-12，激活的Caspase-12可進一步剪切Caspase3而引發(fā)細胞凋亡。

3. 死亡受體途徑：

胞外的死亡信號可通過死亡受體轉(zhuǎn)入胞內(nèi)。死亡受體為一類跨膜蛋白?屬腫瘤壞死因子受體（TNFR）基因超家族。其胞外部分都含有一富含半胱氨酸的區(qū)域，胞質(zhì)區(qū)有一由同源氨基酸殘基構成的結構，有蛋白水解功能，使死亡信號得以進一步傳遞而啟動凋亡。

二、細胞凋亡檢測的方法

1. 形態(tài)學觀察

形態(tài)學觀察就是應用各種染色法可觀察到凋亡細胞的各種形態(tài)學特征，如組織切片或細胞涂片，經(jīng)固定, 用 Giemsa染 色 、孚 爾 根 染 色 或 Hoechest33342等熒光染色, 在光學顯微鏡下鏡檢, 可觀 察到染色質(zhì)凝集、邊緣化、凋亡小體出現(xiàn)、巨噬細胞的吞噬等現(xiàn)象。

2. DNA電泳 

提取細胞基因組DNA, 進行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳, 并用溴化乙錠進行染色時, 凋亡細胞的DNA顯示出 180～ 200 bp及其不同倍數(shù)的梯帶。而壞死細胞的DNA電泳時呈彌散的涂抹狀。

3. TUNEL測定法 

TUNEL測定法又稱 DNA 斷裂原位末端標記法 。由于凋亡細胞DNA為核酸酶所降解產(chǎn)生 3’-OH的缺口和末端，故可用原位缺口平移法或原位末端標記法顯示凋亡細胞。而正常細胞沒有DNA斷裂或者只有少量的DNA發(fā)生斷裂不被顯色。但由于在壞死細胞內(nèi)也可能存在DNA片段化，所以只有DNA鏈普遍斷裂才能證明細胞發(fā)生凋亡。

4.Annexin V／PI 雙染法測定

Annexin V／PI 法是根據(jù)細胞凋亡早期細胞膜的磷脂對稱性發(fā)生改變磷脂酰絲氨酸（PS）由細胞膜內(nèi)移位到細胞膜外，采用 Annexin V／PI 雙染，并通過流式細胞術測定細胞凋亡的方法。Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力，在正常生理條件下，PS主要位于質(zhì)膜的內(nèi)葉。在啟動細胞凋亡時，PS被轉(zhuǎn)移到細胞外膜上。PS一旦到達膜外，即可被Annexin V-FITC結合，從而檢測出細胞的凋亡。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可與雙鏈DNA特異性結合，并產(chǎn)生強烈的熒光，正常情況下無法透過細胞膜。由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，PI可進入細胞內(nèi)對DNA進行染色，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時期的細胞。