一、背景過(guò)高

原因：

1、一抗質(zhì)量不高

2、一抗/二抗?jié)舛忍?/span>

3、封閉不完全

4、洗滌不充分

5、可通過(guò)調(diào)節(jié)熒光顯微鏡的參數(shù)來(lái)減低背景

建議：

1、使用特異性高、效價(jià)高的一抗

2、降低一抗/二抗?jié)舛?/span>

3、增加蛋白封閉時(shí)間

4、增加沖洗次數(shù)與時(shí)

二、信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)

原因：

1、無(wú)目的蛋白或表達(dá)量極少

2、細(xì)胞通透性差

3、抗/二抗?jié)舛忍?/span>

4、抗選擇錯(cuò)誤（種屬不匹配)

建議

1、選用表達(dá)量高的細(xì)胞或組織

2、增加通透劑的作用時(shí)間或濃度

3、增大其濃度

4、選用與一抗種屬相匹配的二抗

三、熒光猝滅快

原因：

1、熒光素本身特性決定，光穩(wěn)定性差

2、用普通的封片劑封片

建議：

1、選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗

2、選用防熒光猝滅劑封片

四、細(xì)胞有自發(fā)熒光原因：

1、使用了戊二醛固定

2、材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光

3、細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細(xì)胞色素等）的含量高;培養(yǎng)細(xì)4、胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例高

建議：

1、在固定后熒光染色前進(jìn)行熒光淬滅，如使用NaI04，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光

2、設(shè)立陰性對(duì)照，通過(guò)降低熒光顯微鏡的參數(shù)來(lái)消除背景染色