細(xì)胞表面分子抗原的流式熒光檢測(cè)是最常用的細(xì)胞分析方法之一。美國(guó) eBioscience 公司為小鼠、人和大鼠 CD 分子和其它膜分子提供了近乎完全的熒光標(biāo)記抗體和純化抗體，成為實(shí)驗(yàn)者研究工作的解決方案。

一、實(shí)驗(yàn)材料

檢測(cè)管（如： Falcon Cat.No.2008 ）或 96 微孔板（ Falcon Cat.No.3910 ）

一抗（標(biāo)記或純化）

Anti-CD16/32 抗體用于封閉 Fc 片段造成的非特異結(jié)合干擾（可選）

熒光二抗（間接標(biāo)記染色）

緩沖液： eBioscience FC Staining Buffer （ Cat.No.00-4222 ）或 PBS （ PH7.4 ）

設(shè)備：移液器、離心機(jī)、冰盒或冰箱、流式細(xì)胞儀

二、注意事項(xiàng)

1. 抗體在使用之前迅速離心幾秒，使所有的液體都集中到管底。

2. 盡量避免直標(biāo)抗體之間的聚集。

3. 抗體應(yīng)避光 4 ℃ 保存，避免凍結(jié)。

4. 樣本的固定保存或較長(zhǎng)時(shí)間放置可能會(huì)影響細(xì)胞表面分子和抗體之間的結(jié)合，故建議盡可能使用新鮮樣品.

三、操作方法

A ．小鼠淋巴組織細(xì)胞表面抗原的流式檢測(cè)步驟

（一） 樣品制備

1. 取出小鼠淋巴組織塊，迅速浸泡在 10ml 的 Staining Buffer 中，并用注射器的活塞研磨或使用兩塊預(yù)冷的載玻片研壓成單細(xì)胞。

2. 把懸液轉(zhuǎn)移到 50ml 的錐形管中靜置片刻，使細(xì)胞團(tuán)塊和碎片沉降到管底，并通過(guò)尼龍網(wǎng) ( 如 Falcon Cat. No. 2350) 過(guò)濾成單細(xì)胞懸液。

3. 4 ℃ 下300-400g離心4-5分鐘，棄去上清液。

4. 如果該樣品為脾臟細(xì)胞，加入一定量的RBC lysis裂解紅細(xì)胞，或者用分離液分離出淋巴細(xì)胞。若為其它樣品，略去此步驟。

5. 加入50ml staining Buffer 重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，根據(jù)需要用 臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。

6. 離心細(xì)胞液并棄去上清；用適量的 Staining Buffer 重懸細(xì)胞為 2 × 107 個(gè) /ml 。若采用直接標(biāo)記的一抗，則加入 CD16/32 抗體（ 0.5-1ug/106 細(xì)胞）冰上孵育 5-10 分鐘。

（二） 細(xì)胞熒光染色步驟

1. 在每個(gè)流式檢測(cè)管或板式微孔中加入 50ul 的稀釋后的一抗（抗體用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）；在空白管 / 孔或同型對(duì)照管 / 孔中加入 50ul Staining Buffer 。若進(jìn)行抗體最 佳濃度測(cè)試，建議范圍 2-0.03ug/106 細(xì)胞。

2. 在各管 / 孔中分別加入 50ul 細(xì)胞懸液（約 106 細(xì)胞），并輕輕混勻。

3. 避光 冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。

（注：有些抗體可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間，建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索）

4. 孵育完成后，加入 Staining Buffer （每流式檢測(cè)管中加 2ml ，而每微孔中加 200ul ）

5. 4 ℃ 下300-400g離心5分鐘，并棄去上清。

6. 重復(fù)洗滌過(guò)程3次。

7. 重懸細(xì)胞后上流式儀檢測(cè)。

a) 若使用的一抗是熒光直接標(biāo)記抗體，用500ul Staining Buffer 重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

b) 若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體，則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素（用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）后于 冰浴或在4℃冰箱中 避光 孵育15-30分鐘。洗滌細(xì)胞兩次（參考第4步和第5步方法）。之后500ul Staining Buffer 重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)。

8. 試驗(yàn)結(jié)果分析。

（注：若要對(duì)多個(gè)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行多色標(biāo)記，則同時(shí)加入熒光標(biāo)記抗體后按以上操作步驟進(jìn)行孵育和細(xì)胞洗滌；操作盡量保持在避光和 4 ℃ 左右的溫度下進(jìn)行。）

B ．人外周血細(xì)胞表面抗原的流式檢測(cè)步驟

1. 在每個(gè)流式檢測(cè)管或板式微孔中加入 50ul 的熒光標(biāo)記或生物素標(biāo)稀釋后的一抗（抗體用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）；在空白管 / 孔或同型對(duì)照管 / 孔中加入 50ul Staining Buffer 。（ eBioscience 公司 tests 規(guī)格抗體為即用型抗體，每個(gè)檢測(cè)管中加入 20ul 該類(lèi)抗體）

2. 每管分別加入 100ul 全血，并輕輕混勻。

3. 室溫避光 孵育15-30分鐘。

（注：有些結(jié)合能力較低的抗體可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間，建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索）

4. 每管分別加入 2ml RBC lysis Buffer （之前預(yù)熱恢復(fù)至室溫），混合均勻。

5. 室溫避光 孵育10分鐘，此孵育時(shí)間不要超過(guò)15分鐘。

6. 室溫 300-400g 離心5分鐘，并棄去上清。

7. 用2ml Staining Buffer 洗滌細(xì)胞一次。

8. 重懸細(xì)胞后上流式儀檢測(cè)。

a) 若使用的一抗是熒光直接標(biāo)記抗體，用500ul Staining Buffer 或 2% 的多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

b) 若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體，則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素（用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）后于 室溫 避光 孵育15-30分鐘。洗滌細(xì)胞1-2次（參考第7步方法）。之后500ul Staining Buffer 或 2% 的多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)。

9. 試驗(yàn)結(jié)果分析。