一、普通PCR

表達載體一般需要的是編碼序列（起始密碼子ATG到終止密碼子TAA/TGA/TGA的序列），也就是NCBI的 coding sequence（CDS）。

一般情況是全長序列，直接取ATG開始的20bp為上游引物，TAA/ TGA/ TAG端的20bp的反向互補序列反向引物。根據(jù)載體的酶切位點、讀碼框的要求在引物的5’端加上內(nèi)切酶堿基即可。

要注意的是：

（1）選用的酶切位點在編碼序列上是否存在，存在就選擇其它酶切位點或者選用同尾酶。

（2）載體的標(biāo)簽是插入在序列的上游還是下游，在上游編碼序列的終止密碼子就要保留，在下游編碼序列的終止密碼子就要去掉。

（3）讀碼框是否正確，有些酶切位點會破壞插入序列的讀碼順序，這個時候在引物上添加堿基使其正常讀碼即可。

例如構(gòu)建EGFP-C1-P53質(zhì)粒

（1） P53序列

綠色表示選取的引物位置（EGFP-C1的GFP標(biāo)簽在插入序列的上游，所以終止密碼子保留。）

引物序列是：上游引物（與綠色標(biāo)示的序列一致）5'-ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3'；下游引物（與綠色標(biāo)示的序列反向互補）5'-TCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3'

（2）載體多克隆位點（MCS）分析

選擇酶的原則是價格便宜，常用的酶，例如XhoI/BamHI/HindIII等，這樣的酶在很多載體中都會有，有時候可以通用。

分析p53的序列中是否有XhoI/BamHI兩個酶切位點，結(jié)果是沒有，那就可以放心的用這兩個酶了。于是引物可以變成：

上游引物  5’-CTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’（XhoI）

下游引物  5’-GGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’（BamHI）

酶在發(fā)揮作用的時候要有個保護堿基，一般就是給它一個空間讓它發(fā)揮作用，保護堿基在百度百科可以查到，于是引物就會變成

上游引物  5’-ccgCTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’

下游引物  5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’

（3）讀碼分析

XhoI的序列CTC GAG與載體的讀碼框不一致，載體的讀碼是 TCT CGA GCT，當(dāng)用XhoI/BamHI雙酶切載體時，最后的CT需要插入序列的AT來代替，就會使插入的序列移碼，這時候，只要在插入序列ATG的前面加CT即可，所以引物序列就變成

上游引物  5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’

下游引物  5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’

所以當(dāng)你給公司發(fā)引物序列時就是

上游引物  5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’

下游引物  5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’

因為是全長序列，就表示引物已經(jīng)定了，沒有選擇。截短體也是一樣的，只要確定了那一段，只要把兩端的20bp作為引物序列，然后添加酶切位點序列就可以了。

二、qPCR引物

這里給大家推薦幾個網(wǎng)站：

①GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design：

https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer#

②Pick primers from a DNA sequence

http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

QPCR設(shè)計的原則是：跨內(nèi)含子，長度在150bp以內(nèi)?，F(xiàn)在的試劑盒已經(jīng)可以不考慮跨內(nèi)含子，用①中的網(wǎng)站只要粘貼CDS的一段序列即可，網(wǎng)頁中有跨內(nèi)含子選項，有些時候跨內(nèi)含子可能無結(jié)果，可以不用選這一項。還是以p53序列為例。顏色不同代表不同的外顯子。

序列越長，分析的越慢，所以不需要全部粘貼。結(jié)果如下：

只需要L1/R1即可，你可以在word中查找引物序列。

第②個網(wǎng)站，是當(dāng)時做基因敲除時候用到的，因為涉及到內(nèi)含子和外顯子都要分析，就會有重復(fù)序列的位置，這個網(wǎng)站可以用[…]將不需要設(shè)計的序列包含在內(nèi)，所以比較符合要求，（重復(fù)序列查找網(wǎng)址http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker，重復(fù)的序列會用NNN標(biāo)示出來）

P53基因序列的一段，下劃線的部分用[….]包括在內(nèi)

結(jié)果如下，除了這些，網(wǎng)頁還會給出備選的引物，你可以隨意挑選。

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