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實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

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分子實(shí)驗(yàn)

熒光定量PCR(QPCR)

一、實(shí)驗(yàn)概念

RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄pcr,其原理是提取組織或細(xì)胞中的總RNA,利用Oligo(dt)或隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA模板,進(jìn)一步通過(guò)PCR反應(yīng)獲得目的基因產(chǎn)物或檢測(cè)其表達(dá)水平。與其他技術(shù)相比,RT-PCR技術(shù)更加靈敏易于操作,在細(xì)胞/組織基因表達(dá)水平的半定量檢測(cè),特定基因cDNA克隆及RNA病毒檢測(cè)等分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。


二、實(shí)驗(yàn)流程

樣本接收→引物合成→提取總RNA→RNA濃度測(cè)定→逆轉(zhuǎn)錄成cdna→熒光定量PCR→數(shù)據(jù)分析


三、注意事項(xiàng)

1.普通PCR及realtime PCR樣本 注意事項(xiàng)

樣本形式

處理方式

保存

運(yùn)輸

可檢測(cè)指標(biāo)數(shù)

新鮮組織

1、 0.1g新鮮組織(至少)

液氮或-80℃

干冰

3-5個(gè)

 

2、 加入1ml的Trizol(可選)

 

 

 

細(xì)胞

1、 培養(yǎng)基吸出棄掉,用PBS洗滌兩次后,吸棄PBS。

液氮或-80℃

干冰

2-3個(gè)

 

2、 每1*10^6個(gè)細(xì)胞加1ml TRIzol,細(xì)胞刮板掛或吹打使細(xì)胞脫落,吹至拉絲狀,收集之后凍存?zhèn)溆谩?/p>

 

 

 

全血

1、大于等于2ml全血加入EDTA或肝素抗凝。

4℃

冰袋

3-5個(gè)

 

2、4h內(nèi)進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離

液氮或-80℃

干冰

詢問(wèn)

體液

1. 12000rpm/min離心10-20min,取沉淀

液氮或-80℃

干冰

詢問(wèn)

1.組織在1-2min內(nèi)完成取材,速凍,,并立即放入-80℃或液氮中保存。
2. 有條件的話,最好先將樣本在液氮中速凍,再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。
3.使用的凍存管最好也用DEPC處理。
4.對(duì)于組織及細(xì)胞樣本,如果沒(méi)有液氮或-80℃冰箱,也可用RNAlater保存,但是組織一定要切成比較小的塊狀,-20℃保存運(yùn)輸。


四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

擴(kuò)增完畢后,進(jìn)入結(jié)果分析界面,看CT值、起始拷貝數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差等,如果是SYBR做的話,再看下溶解曲線。以β-actin為內(nèi)參照基因,與對(duì)照組相比,得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值),將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。